武汉市腹泻婴幼儿隐孢子虫感染的分子流行病学调查.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn武汉市腹泻婴幼儿隐孢子虫感染的分子流#行病学调查*周蕊，刘晓洁5（武汉大学基础医学院人体寄生虫学教研室（武汉430071））摘要：目的了解武汉市2岁以下婴幼儿腹泻患者的隐孢子虫感染状况，为预防隐孢子虫感染提供分子流行病学依据。方法采集2014年8月-2015年7月在湖北省人民医院和武汉大学中南医院就诊的2岁以下婴幼儿腹泻患者的粪便，过滤沉淀后于2.5%重铬酸钾溶液中4℃10保存；采用酚-氯仿法提取基因组DNA、18SrRNA巢式PCR(Nested-PCR)扩增技术检测隐孢子虫感染，并对阳性PCR产物测序；所获序列进行Blastn比对，应用MEGA软件采用邻接法构建系统进化树进行虫种鉴定。结果共收集到298份婴幼儿腹泻患者的粪便样本。经巢式PCR扩增技术检测，298份样品中有9份扩增出隐孢子虫阳性条带，阳性率为3.02%（9/298），其中1～2岁腹泻幼儿阳性率为5.93%(7/118），岁患儿的阳性率为151.11%(2/180)，差异有统计学意义（χ2=4.13；<0.05）。9份阳性PCR产物经测序后与GenBank上的参照序列进行比对，结果显示7份样本为微小隐孢子虫感染，2份样本为微小隐孢子虫与人隐孢子虫混合感染。绘制种系发育进化树发现，9条SSUrRNA基因序列与已发表的微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum）位于同一个进化支上。结论武汉地区婴幼儿腹泻患者中存在隐孢子虫感染，主要感染虫种为微小隐孢子虫。20关键词：微小隐孢子虫；人隐孢子虫；婴幼儿；腹泻；巢式PCR；分子流行病学；武汉中图分类号：R373MolecularepidemiologyofCryptosporidiuminfectionininfantswithdiarrheainWuhanCity25ZHOURui,lIUXiaojie(SchoolofBasicMedicalSciences,WuhanUniversity,185DonghuRoad,Hubei430071,China)Abstract:ObjectiveTounderstandtheprevalenceofCryptosporidiuminfectionindiarrheainfantsunder2yearsoldinWuhanCity,soastoprovidetheepidemiologicalevidenceforthepreventionandtreatmentofcryptosporidiosis.MethodsThefecalsamplesfrominfantsunder2yearsoldwithdiarrhea30werecollectedintheHubeiGeneralHospitalandCentralSouthHospitalinWuhanCity,HubeiProvince,ChinafromAugust2014toJuly2015.Thefecalsampleswerestoredin2.5%potassiumdichromateat4°Cafterfiltered.TheDNAwasextractedfromthefecalpelletswiththephenol-chloroformmethod.TheCryptosporidiumspeciesweredetectedbyanestedPCRassaytargetingtheSSUrMolecularepidemiologyofCryptosporidiuminfectionininfantswithdiarrheain35WuhanCityRNAgeneoftheparasite.AllpositivePCRproductsweresequencedonABI3100automatedsequencer,andtheamplifiedsequenceswerecomparedtohomologoussequencesintheNCBIdatabasebyusingtheBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST).PhylogeneticanalyseswereperformedbyusingthesoftwareMEGA(version4.0)basedontheNeighbour-Joiningmethod.ResultsThehumanstoolspecimens(n=298)werescreenedforthepresenceofCryptosporidiumbynestedPCR.40TheinfectionrateofCryptosporidiumwas3.02%(9/298).TheinfectionrateofCryptosporidiumwas5.93%(7/118）intheinfantsbetween1-2yearsold,andtheinfectionratewas1.11%(2/180)intheinfantsunder1yearold,andtherewasasignificantdifferencebetweenthetwogroups(χ2=4.13;P0.05).TheninesampleswhichwerepositivebynestedPCRweresuccessfullysequencedandcomparedwiththereferencesequencesonGenBank.Theresultsrevealedtheninepositivespecimens45wereallinfectedwithC.parvum,particularly,andtwoofthemwereco-infectedwithC.hominis.Neighbor-joiningtreeswereconstructedfromthealignedpartialSSUrRNAsequencesofthesenine基金项目：国家自然科学基金项目（No.31300744）；湖北省高武汉市腹泻婴幼儿隐孢子虫感染的分子流行病学调查校省级教学改革研究项目（2016005）；武汉大学及医学部教学改革研究项目（2016002）；教育部博士点新基金教师类项目，项目编号为20130141120011作者简介：周蕊，女，教授博导，主要从事病原生物学的研究.E-mail:ruizhou@whu.edu.cn.-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnisolates,andintheSSUrRNAlocus,thenineisolatesweregroupedwithC.parvum.ConclusionThereexistsCryptosporidiuminfectionintheinfantsunder2yearsoldwithdiarrheainWuhanCity,andthemainspeciesofCryptosporidiumisC.parvum.50Keywords:Cryptosporidiumparvum;C.hominis;Infant;Diarrhea;NestedPCR;Molecularepidemiology;WuhanCity0引言55隐孢子虫属机会性致病原虫，可广泛感染人和多种脊椎动物的胃肠道上皮细胞，是引起[1]人和哺乳动物腹泻的重要病原体之一。微小隐孢子虫（Cryptosporidiumparvum,C.parvum）和人隐孢子虫（Cryptosporidiumhominis,C.hominis）是感染人体的主要虫种，感染方式主要[2]是通过摄入被隐孢子虫卵囊污染的水源或食物。对于免疫功能正常者，其感染隐孢子虫后多为自限性腹泻，而对于免疫功能低下的婴幼儿、营养不良者或艾滋病患者，感染后往往导[3]60致比较严重的腹泻，甚至会威胁到生命。最新研究显示，隐孢子虫是导致2岁以下婴幼儿[4]腹泻的重要病原体之一。隐孢子虫在全世界广泛分布。在发达国家的人群感染率为0.60%～20.00%，发展中国[5]家为4.00%～25.00%。国内自1987年在南京地区发现首例人体隐孢子虫病例后，各地陆[6-7][8]续有感染病例报道。据调查，在我国隐孢子虫的感染率为1.40%～10.40%。姜艳艳等对[9]65江苏地区腹泻人群进行检测发现隐孢子虫感染率为1.29%；于子健等报道湖南地区腹泻儿[10]童隐孢子虫感染率为1.40%；陆绍红等报道浙江地区腹泻儿童隐孢子虫感染率为[11][12]10.40%；刘华等报道上海地区腹泻人群隐孢子虫感染率为13.49%。然而，以往的这些报道主要通过形态学检测法如抗酸染色、金胺酚染色和金胺酚-改良抗酸染色等鉴定隐孢子虫虫种。但因不同隐孢子虫虫种的卵囊差异一般较小，并且该方法耗费时长、敏感性较差、[13]70易影响的干扰因素多，所以漏检率较高。分子生物学检测比形态学检测有更高的敏感性[14]和特异性，已被广泛用于隐孢子虫分子流行病学调查。基于隐孢子虫18SrRNA基因的巢式PCR(Nested-PCR)技术是用于隐孢子虫检测的一种常见分子生物学方法，既适用于大样本[15]量的检测，也能用于粪便中卵囊含量较少的轻感染病例的诊断及虫种鉴定，已被证实是隐孢子虫病分子流行病学大规模调查的一种有效手段。鉴于隐孢子虫是引起2岁以下婴幼儿75腹泻的重要病原体，本文通过巢式PCR的方法检测武汉市2岁以下腹泻婴幼儿的隐孢子虫感染和主要虫种，以了解该地区腹泻婴幼儿隐孢子虫的感染情况，为预防隐孢子虫病的传播、以及该病的分子流行病学调查等提供科学依据。1材料与方法1.1材料801.1.1样本2014年8月-2015年7月采集在湖北省人民医院和武汉大学中南医院就诊的2岁以下腹-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn泻婴幼儿的粪便样本，并记录患者年龄、性别、样本采集时间、样本性状特征等相关信息。每个采集的粪便样本均采用去离子水在金属筛子（90孔/25.4mm）过滤，15ml离心管收集过滤液，3500g离心6min，弃上清，加去离子水后振荡混匀，再取适量浑浊液于1.5ml离85心管，3500g离心4min，弃上清，留150mg左右的沉淀保存于2.5%重铬酸钾溶液中，4℃备用。隐孢子虫阳性样本为河南省农业大学馈赠。1.1.2主要试剂无水乙醇、苯酚、氯仿、蛋白酶K购自于武汉启动子生物有限公司，PCRGreenMix购自日本TAKARA公司。引物由武汉天一辉远生物公司合成。901.2方法1.2.1DNA提取将上述保存于2.5%重铬酸钾溶液中的粪便样本，3500g离心3min，水洗3次，去上清，加入500μl细胞裂解液[(100mmol/LNaCl，20mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，20mmol/LTris-HClpH7.5，10%十二烷基磺酸钠(SDS)]，反复冻融（液氮中2min，95℃热水中952min，重复3次），加入20μl蛋白酶K，4μl无RNA酶，37℃摇床过夜。超声破碎，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25：24：1)至上述样品处理液中抽提2次,吸取水相，加入2倍体积的冷无水乙醇混匀，-20℃1h，12000g离心8min，弃上清，抽干，溶于20μl蒸馏水中，20℃保存备用。1.2.218SrRNA巢式PCR扩增和测序[14]100根据隐孢子虫18SrRNA序列设计巢式PCR引物，其中外引物为F1:5’-TTCTAGAGCTAATACATGCG-3’、R1:5’-CCCTAATCCTTCGAAACAGGA-3’；内引物为F2:5’-GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG-3’、R2:5’-AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA-3’。扩增产物约830bp。目的基因巢式PCR扩增采用20μl反应体系：灭菌双蒸水6μl，PCRGreenMix10μl，上、下游引物各1μl(10μM)，总DNA(模板)2μl。两次PCR反应105条件均为为94℃预变性3min，94℃变性3Os，55℃退火30s，72℃延伸lmin，共需39个循环，72℃终延伸12min。扩增产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性的PCR产物送武汉天一辉远有限公司纯化测序。1.2.3系统发育树分析应用ClustalX软件对测定的基因序列与从GenBank上下载的参照序列进行比对，然后110用MEGA4.0的邻接法(Neighbour—Joiningmethod，NJ)建系统发育进化树，用自展值检验(Bootstraptest)估计所建系统发育进化树的可靠性，重复次数为1000次。1.2.4统计学分析应用SPSSl9．0统计软件进行数据分析，隐孢子虫的感染率间差异比较用卡方检验，以P<0.05时为差异有统计学意义。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1152结果2.1隐孢子虫感染特征共收集到298份2岁以下腹泻婴幼儿粪便样本。经18SrRNA巢式PCR扩增检测，发现隐孢子虫阳性9份，阳性率为3.02%(9/298)（图1）。其中隐孢子虫检测阳性患者粪便以水样状或粘稀液状为主。1岁组患者的阳性率为1.11%（2/180），1～2岁者阳性率为5.93%120（7/118）；男性患者阳性率2.76%（4/145），女性患者阳性率3.27%（5/153），2个年龄2组之间隐孢子虫检测阳性率差异有统计学意义（=4.13，P0.05），性别间差异无统计学2意义（=0.01，P0.05）。患者的隐孢子虫检测阳性率以夏季和秋季相对较高，其中秋季2阳性率最高、为4.21%(4/95)（表1），但各季节间的阳性率差异无统计学意义（=1.30，P0.05）。125M：DNA标记；1：阳性对照；2：阴性对照；3-7：粪便标本M：DNAmarker;1：Positivecontrol;2:Negativecontrol;3-7:Fecalsamples图1腹泻儿童粪便中隐孢子虫巢式PCR鉴定结果Fig.1NEST-PCRresultsofCryptosporidiuminfecalfrominfantswithdiarrhea130表1门诊隐孢子虫腹泻感染者感染时间分布（2014年8月-2015年7月）Table1PrevalenceofCryptosporidiumamonginfantswithdiarrheabyseason(August2014toJuly2015)人数阳性率感染时间阳性人数虫种TotalPositiverateInfectiontimePositivenumberSpeciesnumber（%）微小隐孢子虫1-3月5012.00Cryptosporidiumparvum1例为微小隐孢子虫和人隐孢子虫混合感染，2例为微小隐孢子虫4-6月8533.53OnecaseofC.parvumandC.hominisco-infection,2casesofC.parvuminfection1例为微小隐孢子虫和人隐孢子虫混7-9月9544.21合感染，3例为微小隐孢子虫-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnOnecaseofC.parvumandC.hominisco-infection,3casesofC.parvuminfection微小隐孢子虫10-12月6811.67C.parvum合计29893.02Total2.2隐孢子虫的基因型特征135阳性PCR产物经测序后于GenBank上的参照序列进行比对。结果显示7份阳性样本感染的隐孢子虫为微小隐孢子虫，2份样本为微小隐孢子虫与人隐孢子虫混合感染。采用MEGA4.0绘制种系发育进化树(图2)，发现9条SSUrRNA基因序列与已发表的微小隐孢子虫处于同一进化分支上。140图2人源隐孢子虫分离株SSUrRNA基因种系发育树Fig.2PhylogeneticanalysisofSSUrRNAofCryptosporidiumspecies3讨论本研究采用较高灵敏性和特异性的巢式PCR法，对武汉地区湖北省人民医院和武汉大学中南医院医院2岁以下腹泻婴幼儿进行为期一年的分子流行病学调查。结果显示，2岁以下腹-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[16]145泻婴幼儿隐孢子虫感染率为3.02%(9/298)，与国内的平均感染水平(0.32%～15.22%)一致。有研究者通过对多个国家及地区的近1000份样本调查发现，隐孢子虫是导致1-11个月婴幼[4]儿腹泻的仅次于轮状病毒的第2大病原体、11-23个月婴幼儿腹泻的第3大病原体；并且有研究发现，隐孢子虫感染往往与儿童营养不良和生长缺陷相关，即使未表现出临床症状也可[17]引起生长发育缓慢等相关影响。150本研究发现，1～2岁腹泻幼儿的隐孢子虫感染率高于0～1岁婴儿。与国内杜学利的报道[18]相符，原因可能是1岁以内的婴儿以母乳喂养为主，抵抗力较强，因此感染率也相对较低。随着年龄的增长，幼儿进食开始以家用餐为主，一定程度上增加接触不洁饮食的机会，从而导致隐孢子虫的感染率增高；但这一结果与GEMS报道不同，其可能是不同的地理差异和中[4]外生活习惯的不同等造成的。本研究中未发现隐孢子虫感染的发生与性别有明显关系，与[19]155以往的文献报道相符。前期文献报道显示，隐孢子虫的感染率在不同季节存在显著差异，[20-21]夏、秋季感染率相对较高，但本研究调查显示，夏秋季的感染率高于冬春季，但不同季节间的差异无统计学意义,是否有受调查样本量等的影响，则有待进一步调查验证。[22]最新研究表明，隐孢子虫包含30多种虫种，其中微小隐孢子虫和人隐孢子虫是感染[23][15]人类的两种主要虫种。并且隐孢子虫的种类因地理位置的不同而分布不同。在中东地[24]160区，人感染的主要虫种为微小隐孢子虫，而在一些发展中国家人隐孢子虫则是主要感染[25][26]虫种。在欧洲国家，这两种隐孢子虫在人群中的感染均较为常见。在我国，人隐孢子[27-28][10,29]虫感染的报道多见于中国东部地区，微小隐孢子虫的感染报道则多见于湖南省。本次调查发现主要为微小隐孢子虫，也存在与人隐孢子虫混合感染现象，与湖南省曾报道的虫[10]种一致,这一结果是否与武汉和湖南相近的地理位置有关，则有待进一步研究。165总之，本次调查在武汉地区婴幼儿腹泻患者的粪便中发现了隐孢子虫卵囊，证明武汉地区中确有隐孢子虫感染。由于目前针对隐孢子虫感染尚无十分有效的治疗药物，因此应重视婴幼儿的喂养卫生，避免隐孢子虫的感染。[参考文献]170[1]GomezMoralesMA,PozioE.HumoralandcellularimmunityagainstCryptosporidiuminfection[J].CurrDrugTargetsImmuneEndocrMetabolDisord,2002,2(3):291-301.[2]LeavBA,MackayM,WardHD.Cryptosporidiumspecies:newinsightsandoldchallenges[J].ClinInfectDis,2003,36(7):903-908.[3]StriepenB.Parasiticinfections:Timetotacklecryptosporidiosis[J].Nature,2013,503(7475):189-191.175[4]KotloffKL,NataroJP,BlackwelderWC,etal.Burdenandaetiologyofdiarrhoealdiseaseininfantsandyoungchildrenindevelopingcountries(theGlobalEntericMulticenterStudy,GEMS):aprospective,case-controlstudy[J].Lancet,2013,382(9888):209-222.[5]韩范,谭渭仙,周性兰.南京地区人体隐孢子虫病2例报告[J].江苏医药,1987,13(12):692-703.［6］徐有贵，姚福宝.江苏省徐淮地区人体隐孢子虫病的调查[J].中国寄生虫病防治杂志,1991，3(1):42-43.180［7］赵雪妮，张冬梅，张立宪，等.哈尔滨地区婴幼儿隐孢子虫感染调查[J].中国寄生虫病防治杂志,1997，9(03):75.[8]LvS,TianLG,LiuQ,etal.Water-RelatedparasiticdiseasesinChina[J].IntJEnvironResPublicHealth,2013,10(5):1977-2016.[9]JiangY,RenJ,YuanZ,etal.CryptosporidiumandersoniasanovelpredominantCryptosporidiumspeciesin185outpatientswithdiarrheainJiangsuProvince,China[J].BMCInfectDis,2014,14(期缺失):555.-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[10]YuZ,LiF,ZengZ,etal.PrevalenceandclinicalsignificanceofCryptosporidiuminfectioninpatientswithhepatitisBvirus-associatedacute-on-chronicliverfailure[J].IntJInfectDis,2011,15(12):e845-e848.[11]陆绍红,林爱芬,陈睿,等.浙江省儿童隐孢子虫感染的诊断及分析[J].中国人兽共患病杂志,2000,16(1):42-44.190[12]LiuH,ShenY,YinJ,etal.PrevalenceandgeneticcharacterizationofCryptosporidium,Enterocytozoon,GiardiaandCyclosporaindiarrhealoutpatientsinChina[J].BMCInfectDis,2014,14(25):25.[13]RamirezNE,WardLA,SreevatsanS.Areviewofthebiologyandepidemiologyofcryptosporidiosisinhumansandanimals[J].MicrobesandInfection,2004,6(8):773-785.[14]XiaoL.Molecularepidemiologyofcryptosporidiosis:anupdate[J].ExpParasitol,2010,124(1):80-89.195[15]RaccurtCP.WorldwidehumanzoonoticcryptosporidiosiscausedbyCryptosporidiumfelis[J].Parasite,2007,14(1):15-20.[16]蔡茹,李朝品,王健,等.淮南地区腹泻患者隐孢子虫感染的调查[J].热带病与寄生虫学,2003,1(1):26-28.[17]PutignaniL,MenichellaD.Globaldistribution,publichealthandclinicalimpactoftheprotozoanpathogen200cryptosporidium[J].InterdiscipPerspectInfectDis,2010(期缺失):366-366.[18]杜学利,戈建军,秦圆方,等.南京市儿童医院门诊儿童隐孢子虫病的流行病学调查[J].热带医学杂志,2009,9(4):382-385,391.[19]李朝品,王克霞,王健,等.安徽省隐孢子虫病流行情况的调查[J].第四军医大学学报,2004,25(2):125-127.205[20]ChalmersRM,ElwinK,HadfieldSJ,etal.SporadichumancryptosporidiosiscausedbyCryptosporidiumcuniculus,UnitedKingdom,2007-2008[J].EmergInfectDis,2011,17(3):536-538.[21]LeitchGJ,HeQ.Cryptosporidiosis-anoverview[J].JBiomedRes,2012,25(1):1-16.[22]FayerR.TaxonomyandspeciesdelimitationinCryptosporidium[J].ExpParasitol,2010,124(1):90-97.[23]XiaoL,FayerR,RyanU,etal.Cryptosporidiumtaxonomy:recentadvancesandimplicationsforpublic210health[J].ClinMicrobiolRev,2004,17(1):72-97.[24]MeamarAR,GuyotK,CertadG,etal.MolecularcharacterizationofCryptosporidiumisolatesfromhumansandanimalsinIran[J].ApplEnvironMicrobiol,2007,73(3):1033-1035.[25]AjjampurSS,SarkarR,SankaranP,etal.SymptomaticandasymptomaticCryptosporidiuminfectionsinchildreninasemi-urbanslumcommunityinsouthernIndia[J].AmJTropMedHyg,2010,83(5):1110-1115.215[26]DesaiNT,SarkarR,KangG.Cryptosporidiosis:anunder-recognizedpublichealthproblem[J].TropParasitol,2012,2(2):91-98.[27]PengMM,MatosO,GateiW,etal.AcomparisonofCryptosporidiumsubgenotypesfromseveralgeographicregions[J].JEukaryotMicrobiol,2001,Suppl(期缺失):28S-31S.[28]WangR,ZhangX,ZhuH,etal.GeneticcharacterizationsofCryptosporidiumspp.andGiardiaduodenalisin220humansinHenan,China[J].ExpParasitol,2011,127(1):42-45.[29]FengY,WangL,DuanL,etal.Extendedoutbreakofcryptosporidiosisinapediatrichospital,China[J].EmergInfectDis,2012,18(2):312-314.-7-'