水通道蛋白的研究进展.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#水通道蛋白的研究进展122**马生飞，毛静远，王贤良（1.天津中医药大学研究生院，天津300193；52.天津中医药大学第一附属医院，天津300000）摘要：水通道蛋白（AQPs）可调节水跨膜转运，目前在哺乳动物体内发现的AQPs有13种（AQP0-AQP12），广泛分布于机体各个部位的组织细胞中。研究表明，通过cAMP-PKA信号通路激活AQPs，增加膜对水的通透性，且膜的通透性受PH值、温度、渗透压影响。中医药10能够影响AQPs基因表达，从而增加膜对水的通透性，为临床治疗提供新的靶点。关键词：分子生物学；水通道蛋白；中医药；研究进展中图分类号：R34人体生物化学、分子生物学ResearchProgressofAquaporins12215MAShengfei,MAOJingyuan,WANGXianliang(1.GraduateSchool,TianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300193;2.FirstTeachingHospitalofTianjinUniversityofTraditionalChineseMedicine,Tianjin300000)Abstract:Aquaporin(AQPs)regulateswatertransmembranetransport,and13kindsofAQPs(AQP0-AQP12)foundinmammalsarewidelydistributedinvarioustissuesofthebody.Studies20shownedthatcAMP-PKApathwaycouldactivatetheAQPstoincreasemembranepermeabilityofwater,andthepermeabilityofmembranewasaffectedbypHvalue,temperatureandosmoticpressure.TraditionalChinesemedicinecouldaffecttheexpressionofAQPsgenetoincreasethemembranepermeabilitytowater,whichprovidesanewtargetforclinicaltreatment.Keywords:molecularbiology;aquaporin;traditionalChinesemedicine;researchprogress250引言水通道蛋白（AquaporinAQPs），又名水孔蛋白，是一种位于细胞膜上的蛋白质（内在膜蛋白），在细胞膜上组成“孔道”，可控制水在细胞的进出。它的发现在分子水平揭示了水跨膜转运调节的基本机制。30水通道蛋白最初是美国科学家PeterAgre在1988年偶然在红细胞膜上发现，称为形成通道的整合膜蛋白28（CHIP），1991年，研究人员完成对其cDNA克隆并进一步确定其为[1,2]细胞膜上转运水的特异性通道蛋白，并称其为AQP1。1997年国际基因组把它正式命名为水通道蛋白（AQPs）。以后研究中又陆续从哺乳动物的组织中鉴定出了12种水通道蛋白，它们与先前克隆的晶体纤维中的主要内源性蛋白（majorintrinsicprotein，MIP）有20%～40%35的同源性氨基酸序列，目前所发现的水通道均属MIP家族，经后来的研究证明MIP亦有弱[3-5]的水通道活性，被命名为水通道蛋白0（AQP0）。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20131210110005）作者简介：马生飞（1987-），男，博士研究生，中西医结合心血管内科通信联系人：毛静远（1962-），男，主任医师，博士生导师，中西医结合心血管内科.E-mail:jymao@126.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1水通道蛋白的结构AQPs属古老的通道蛋白MIP（majorintrinsicprotein）家族成员，序列分析显示基因[6]40内部由两个重复单元组成。MIP家族不同成员之间的基因序列具有一定的同源性，其中NPA（Asn-Pro-Ala）修饰子区段同源性最强。已有的证据还表明MIP成员之间的基因组织方式也具相似性，一个大的外显子编码N端半分子，三个小的外显子编码MIP分子的C端[7]半分子。N端部分在不同成员之间同源性较高，它可能负责一般的或共同的功能，C端部分得到了分化，使得不同的蛋白质具有特殊的功能。截止现在，在哺乳动物体内发现的水通45道蛋白有13种（AQP0-AQP12），前11种AQPs均具有天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸（Asn-Pro-Ala，NPA）特征序列，但近年发现的AQP11天冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸序列的保[8]守性较差。所有已知的哺乳动物AQPs同源物具有类似特征，它们约含250-290个氨基酸，不同AQPs的差异位于N端C端。目前有关AQPs详细的结构和功能信息主要来自对红细胞膜上50的AQP1的研究。AQP1初级结构信息主要来自对AQP1cDNA的分析，与所有的MIP成员一样，AQP1含有六个跨膜区段并由五个环相连，其中B、D环位于细胞内，A、C、E环位于细胞外，A环上有一个糖苷化位点（其他AQPs成员的糖苷化位点位于C环上）。AQPs[9][10]分子的C端和N端位于胞质侧。Haris等利用傅利叶红外光谱（FTIR）分析了AQP1的[11]二exlpore级结构，结果表明AQP1含36%A螺旋，42%B折叠片（B-sheet）。Cabiaux等55比较了AQP1与细菌视紫红质FTIR光谱，结果显示AQP1是一个完全的螺旋蛋白，B折叠片含量极少甚至没有。2水通道蛋白的分布及其功能应用免疫组织化学、RT-PCR、免疫电镜、原位杂交等方法发现AQPs广泛分布于机体[12]的组织细胞中，尤其是与液体分泌及吸收有关的上皮细胞、内皮细胞。60AQP0原名晶状体纤维膜主要固有蛋白，在晶状体囊内的纤维细胞表达，与晶状体的透明度有关，AQP0的突变可能导致晶状体水肿和白内障，小鼠缺乏AQP0将患先天性白内[13]障。AQP1是一种整合膜蛋白，也称为原型水通道，在身体的多个组织中有表达。AQP1缺[14]乏的人肺血管通透性增高，提示AQP1是肺血管渗透性的决定性因素。未怀孕的大鼠脂[15]65肪垫中有AQP1表达，考虑与乳汁的分泌和合成可能有关。AQP1在胆管上皮质膜有表达，[16]可能在与分泌功能有关的位置。鼻粘膜下层的纤维原细胞有AQP1的表达也说明AQP1[17]可能在液体分泌方面的作用。还有研究显示，AQP1表达于睾丸输出小管上的非纤毛上皮[18]细胞，可能与对水的重吸收功能有关。除此以外，耳蜗内的多个区域均有AQP1分布，[19]考虑与耳内的水平衡调节有关。AQP1在关节软组织中的表达，其功能与水、小分子溶质[20]70等通过细胞浆膜有关。AQP1高水平表达在前列腺、卵巢、乳腺及肺部的肿瘤中，也说明-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[21]其在水肿的形成与消除中可能起着重要的作用。AQP2主要分布于肾脏，是肾脏调节水液代谢的关键蛋白，敲除AQP2可引起大鼠先天[22][23]性尿崩症，肾原性的尿崩症鼠AQP2的低水平表达也证明了这点。有研究显示心力衰竭伴低钠血症时，肾脏AQP2蛋白表达显著增加，说明AQP2与充血性心力衰竭机体水滞[24]75留密切相关。[25]AQP3主要在气管、肺泡、胃肠粘膜细胞、肾集合管、泪腺等细胞中表达。AQP3不仅允许水的通透，而且能够让甘油或尿素等小分子通过。AQP3与肾脏浓缩尿液能力密切相[26]关，AQP3缺失会导致小鼠多饮多尿。AQP3在关节软骨组织有表达，说明它可能与甘油[17]及其他代谢产物通过软骨细胞的浆膜有关。80AQP4主要分布于软脑膜、脑室等与脑脊液接触的组织中以及脑实质的血管周围[27]。[28]脊髓灰质中的血管周围AQP4亦有强表达。由此推测，AQP4与脑细胞间的水转运密切相[29]关。研究也发现AQP4缺失鼠脑部对于水的渗透性减弱。缺血性脑水肿大鼠脑部AQP4[30]呈高表达。AQP5主要分布在肺泡、外分泌腺、角膜的上皮细胞，对尿素以及甘油亦有较强的通透[31][32]85性。AQP5基因敲除小鼠唾液分泌显著减少，说明APQ5与唾液分泌相关。AQP5基因[33]敲除小鼠肺泡-毛细血管膜屏障水通透性降低10倍，AQP5还可能参与肺内炎症时肺内液[34][35]体转运异常有关，AQP5敲除能够导致气道粘膜下腺分泌减少，说明AQP5与肺水肿的形成与消退具有密切关系。另外，AQP5还在耳旁腺体分泌颗粒的膜上具有表达，说明AQP5[36]可能与其渗透调节有关。90AQP6只分布于肾，并且在肾脏的表达非常有限，与其他水通道蛋白不同，AQP6并非真正意义上的水通道蛋白，而是一种阴离子选择性通道，研究发现，AQP6能在开放和关闭[37]间快速转换，在这个过程中天冬酰胺起着重要作用。AQP7主要分布于肠道及肾近直小管，AQP7蛋白在肠道上皮细胞的高度表达说明其可[38]能与肠道上皮细胞快速转运水的功能有关。研究发现AQP7基因敲除小鼠肾近直小管对95水的通透性显著降低，甘油浓度显著增加，说明AQP7在肾近直小管对水、甘油的重吸收过[39]程中发挥着重要作用。AQP7基因敲除的大鼠16周后体重是野生型大鼠的3.7倍，AQP7基因敲除大鼠的脂细胞迅速增大，脂细胞内聚集大量甘油和甘油三酯，也证明了AQP7在甘[40]油转运中的重要作用。AQP8在哺乳动物的胃肠道、睾丸、肾、心脏、气管中都有表达。在促卵细胞成熟激素[41]100的作用下，AQP8在卵泡粒层细胞呈高度表达，推测AQP8在卵泡发育过程中起重要作用。Calamita等研究证实AQP8在胆囊上皮细胞顶膜上有表达，推测AQP8可能与胆汁的重吸收[42]有关。[43]AQP9在垂体前叶、视网膜、胃肠道、甲状腺等部位都有分布。Amiry等人研究发现在线粒体内膜上含有丰富的AQP9异构体，提示了AQPs在能量代谢中发挥重要作用，AQP9[44]105是脑星形胶质细胞的重要特征，推测AQP9可能与帕金森病易受损的神经有关。Wang等[45]的实验表明AQP9在羊膜水转运过程中起重要作用。[46]AQP10主要分布于小肠、十二指肠，对水、尿素、甘油均具有渗透性。AQP10表达[47]于肠吸收性上皮细胞，说明它可能是水和其他小分子物质通过肠道黏膜的通道。AQP10[48]在小肠绒毛内皮细胞中有分布，说明AQP10可能在小肠吸收养份过程中发挥着作用。110AQP11主要分布于肾脏近端小管，AQP11基因敲除大鼠的肾脏近端小管出现胞囊化，[49]大鼠因肾脏多囊引起的肾衰竭死亡，推测AQP11对肾脏近端小管的功能有重要作用。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnAQP12分布于胰腺的腺泡细胞的细胞器上，推测AQP12可能与分泌颗粒的胞外分泌等[50]功能有关。3水通道蛋白的调控1153.1蛋白激酶AQP2在细胞质膜上以四聚体形式存在，每一个单体都是独立的功能单位，均由271个氨基酸所组成，呈螺旋、对称重复串联结构跨膜6次，形成5个线性环（LoopA、B、C、D、E），分布于质膜两侧，肽链的N端、C端位于细胞膜的内侧，C端的第256位的是丝氨酸，是蛋白激酶A（PKA）使AQP2磷酸化的位点，PKA是环磷酸腺苷（cAMP）依赖的[51][52]120。在抗利尿激素（ADH）的诱导下，调节AQP2的研究中发现的AQP2“穿梭机制”。AQP2生理条件下最主要受血管加压素（AVP）调节。其调节方式有两种，即短期调节和长期调节。加压素对AQP2的快速调节作用又称为短期调节，有关AQP2短期调节的研究证明，加压素通过作用于H型加压素受体（V2受体），激活腺苷酸环化酶（AC），后者作用于ATP，使之转化为cAMP，激活蛋白激酶A（PKA），将AQP2C端的第256位丝氨酸磷酸125化，AQP2的囊泡向管腔膜转移并融合嵌入管腔膜，管腔膜上的AQP2密度增加，使水的通[53-55]透性提高。除了“穿梭机制”的短期调节外，持续高水平AVP会使AQP2基因表达量[56]提高，即长期调节作用，其机制是cAMP作为第二信使参与AQP2的表达调控，cAMP活化cAMP依赖的PKA，PKA能够将cAMP的应答元件结合蛋白（CERB）磷酸化，然后与DNA结合，从而增加转录。另外，活化蛋白（AP1）的作用位点能够协同cAMP结合元130件控制AQP2的转录，APl通过与c-fos/c-jun蛋白结合并激活，激活的AP1能够与DNA相[57-58][59]结，从而增加AQP2的转录。Amorini等研究发现PKC的活化剂佛波醇酯能够通过磷酸化的方式调节AQP4活性，但只在mRNA转录水平降低AQP4的活性，即PKC在转录水平方面对AQP4mRNA进行调节。AQP1、AQP5均含有PKA/C磷酸化同源序列（PPCS），PKA/C与AQP上的PPCS作用，催化水通道蛋白上的丝氨酸磷酸化，从而增加膜对水的通[60-61]135透性。研究表明，PKC能够对AQP1进行磷酸化修饰，AQP1的磷酸化能够提高AQP1[62]介导水的通透性和离子导电率，进而使AQP1发挥水液转运等生理功能。3.2PH值AQPs的一级结构A环和C环的组氨酸决定了AQPs的PH值依赖性。组氨酸的位置可[63]以调节AQps对pH值的敏感性。研究发现，当pH值降至6.5时，AQP0对水的通透性显[64]140著提高，星形胶质细胞于5mmol/l的NH4Cl中暴露10h，可以发现AQP4的表达显著增高，当pH为5.5时，AQP4可以对水、乳酸盐表现特殊通透性，AQP4表达升高后，星形细[65]胞可以发生肿胀。3.3温度[66]Fujita等研究在低氧、亚低温条件下星形胶质细胞AQP4，AQP5，AQP9的表达，结145果发现在32℃时，AQP5mRNA恢复到基础水平，AQP4mRNA短暂下降后成倍增长，[67]AQP9mRNA表达降至37℃水平。xiao等研究正常体温下诱导的心脏停跳的小鼠，发现其脑内AQP4的表达升高，而亚低温下，其脑内AQP4的表达降低，与脑水含量测定结果一致。在细胞水平从分子生物学角度揭示了亚低温对脑的保护机制。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn3.4渗透压150研究发现，高渗环境能够通过调节AQP1的表达调节腹膜对水的通透性，减缓腹水的积累。Lanaspa等研究发现，向培养肾脏髓质细胞培养基中加入NaCl，可以使AQP1mRNA[68]和蛋白表达增加。4中医药对水通道蛋白的影响马民等采用活血温阳益气复方治疗阿霉素所致慢性心衰大鼠发现，活血温阳益气复方能[69]155够纠正心衰大鼠肾髓质AQP2的表达；宋业琳等采用采用补肾活血汤治疗自发性高血压[70]病慢性心衰大鼠，结果发现大鼠肾脏组织AQP2的表达水平下降；邬真力等采用结扎左冠状动脉致慢性心衰大鼠模型，观察猪苓、茯苓对慢性心衰大鼠的影响，结果发现猪苓和茯[71]苓均能是大鼠尿液AQP2排泄率较对照组明显降低。郭志军等通过研究加参方对慢性充血性心衰大鼠肺脏水通道蛋白的影响发现，加参方能够对慢性心衰大鼠肺脏水通道蛋白1、[72]1604、5mRNA表达异常产生一定的影响，从而有效清除肺内多余液体，减轻心衰大鼠肺水肿。5小结综上所述，随着现代医学对AQPs的分布、结构、功能以及调控的深入研究，人类能够在分子的水平上研究水的转运，为人类研究水液代谢、转运提供了新的平台，也为相关疾病的病机有了进一步的认识，从而为临床治疗提供新的靶点。165[参考文献](References)[1]AgreP,SasakiS,ChrispeelsMJ.Aquaporins:afamilyofwaterchannelproteins[J].AmericanJournalofPhysiology-RenalPhysiology,1993,265(3):F461.[2]DenderBM,SmithBL,KuhajdaFP,etal.Identification,purifi-cationandpartialcharacterizationofanovelMr28,000integralmembraneproteinfromerythrocytesandrenaltubules[J].JBiolChem,1988,263(30):17015634-15642.[3]Wing-KeeL,FrankT.Aroleformitochondrialaquaporinsincellularlife-and-deathdecisions?[J].PhysiolCellPhysiol,2006,291(2):195-202.[4]BengaG.Birthofwaterchannelproteins-theaquaorins[J].CellBiolInt,2003,27(9):701-709.[5]ChouCI,MarT,YangB,eta1.Fourfoldreductionofwaterpermeabilityininnermedullarycollectingductof175aquaporin-4knockoutmice[J].AmJPhysiol,1998,274(2):C549-C554.[6]ReizerJ,ReizerA,SaierMH.TheMIPfamilyofintegralmembranechannelproteins:Sequencecomparisons,evolu-tionaryrelationships,reconstructedpathwayofevolutionandproposedfunctionaldifferentiationofthetworepeatedhalvesoftheproteins.CritRevBiochemMolBiol,1993,28(1):235-257.[7]KingLS,AgreP.Pathophysiologyoftheaquaporinwaterchannels[J].AnnuRevPhysiol,1996,58(58):180619-648.[8]MorishitaY,SakubeY,SasakiS,etal.Molecularmechanismsanddrugdevelopmentinaquaporinwaterchanneldiseases:aqua-porinsuperfamily(superaquaporins):expansionofaquaporinsre-strictedtomulticellularorganisms[J].JournalofPharmacologicalSciences,2004,96(3):276-279.[9]StamerWD,SnyderRW,ReganJW.Characterizationofthetransmembraneorientationofaquaporin-1using185antibod-iestorecombinantfusionprotein[J].Biochemistry,1996,35(50):16313-16318.[10]HarisPI,ChapmanD,BengaG.Afourier-transforminfraredspectroscopicinvestigationofthehydrogen-deuteriumexchangeandsecondarystructureofthe28-kDachannel-formingintegalmembraneprotein(CHIP28)[J].EurJBiochem,1995,233(2):659-664.[11]CabiauxV,ObergKA,PancoskaP,etal.Secondarystructurescomparisonofaquaporin-1and190bacteriorhodopsin:afouriertransforminfraredspectroscopystudyoftwo-di-mensionalmembranecrystals[J].BiophysJ,1997,73(1):406-417.[12]YangB,MaT,VerkmanAS.Erythrocytewaterpermeabilityandrenalfunctionindoublenockoutmittlackingaquaporin-1andaquaporin-3[J].JBiolChem,2001,276(1):624-628.-5- 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