硫化氢合成酶在SVZ区神经干细胞中的表达鉴定及硫化氢对神经干细胞增殖的影响.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn硫化氢合成酶在SVZ区神经干细胞中的表#达鉴定及硫化氢对神经干细胞增殖的影响**袁雨晴，胡丽芳，杜陈陈5（苏州大学神经科学研究所,江苏省苏州市邮编215123）摘要：为探讨硫化物对SVZ区神经干细胞增殖的影响，本研究分离C57BL小鼠胚胎（E13-14）SVZ区神经干细胞进行体外培养，悬浮培养的神经球传代贴壁培养2次后用于实验，首先通过干细胞表面标记物nestin及Sox2免疫荧光共染鉴定神经干细胞，结果所获得的细胞为10神经干细胞。其次，使用免疫荧光结合westernblot及反转录PCR的方法鉴定胚胎神经干细胞内硫化氢内源性合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionineβ-synthase,CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionineγ-lyase,CSE）的表达，Q-PCR测定CBS与CSEmRNA的相对含量；免疫荧光方法鉴定成年C57BL小鼠SVZ区及胎鼠E14脑组织切片中CBS、CSE及nestin的表达。实验结果表明在成年C57BL小鼠SVZ区及体外培养的神经干细胞内CBS均有较15高含量的表达及胎鼠E14脑组织切片及体外培养的神经干细胞内CSE的表达。最后，硫化氢供体NaHS作用于成年小鼠后后，利用Brdu免疫荧光染色法检测到神经干细胞的大量增殖。关键词：神经生物学；硫化氢；神经干细胞；增殖；胱硫醚-β-合成酶；胱硫醚-γ-裂解酶中图分类号：R741.02文献标识码：A20TheexpressionofhydrogensulfidesynthaseinneuralstemcellsofSVZandtheeffectofhydrogensulfideonproliferationofneuralstemcellsYUANYuqing,HULifang,DUChenchen25(InstituteofNeuroscience,SoochowUniversity,Suzhou,JiangsuProvince,215123,China)Abstract:TostudythepossibleeffectsofH2Sonneuralstemcellsproliferationinmousesubventricularzone(SVZ).Neuralstemcells(NSCs)wereisolatedfromSVZofE13-14C57BLmouse.Forneurospherecountingexperiment,theembryonicNSCsofthe2ndto4thpassagewereusedinthisstudy.TheNSCsspecificmarkersnestinandSox2wereusedforidentificationandlabelingof30NSCsinimmunofluorescentstudy.Andtheresultshowedthatabout99%oftheisolatedembryonicNSCswerepositivelystainedwithNSCsspecificmarkersnestinandSox2.Thenimmunofluorescentstaining,westernblotandRT-PCRwereappliedtoidentifythedistributionandexpressionofH2S-producingenzymesincludingcystathioninebetasynthase(CBS)andcystathioninegamma-lyase(CSE)inembryonicNSCs,adultSVZareaofC57BLmiceandinthebrainofembryonicE14,which35revealedCBSexpressionanditsco-localizationwithnestinintheadultSVZofC57BLmice,aswellasinvitroculturesofNSCs.CSEwasdetectedinthebrainofembryonicE14andinvitroculturesofembryonicNSCs.Atlast,BrduincorporationassayincombinationwithimmunofluorescentstudywereappliedtodetecttheproliferationofNSCsinadultmicefollowingtreatmentwithH2SdonorsNaHS,whilethedatashowedthatH2SdonorspromotedtheproliferationofNSCsinmouseSVZ.40Keywords:neurobiology;hydrogensulfide;neuralstemcell;proliferation,cystathioninebetasynthase;cystathioninegamma-lyase基金项目：江苏省高校自然科学基金面上项目（11KJB310010）作者简介：袁雨晴（1992年2月），女，主要研究方向：帕金森病的病理机制通信联系人：胡丽芳（1978年9月）女,副教授、硕导，帕金森病的病理机制.E-mail:hulifang@suda.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言45硫化氢（hydrogensulfide，H2S）最初被认为是一种有臭鸡蛋气味的毒性气体。直到1989年，研究者在大鼠及人脑中检测到了内源性产生的H2S，这提示H2S在体内可能发挥一定的[1]生理作用。H2S在体内主要由胱硫醚-β-合成酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）两种酶[2]合成。已有文献报道，H2S参与多种神经疾病的发生、发展及损伤修复过程。在神经系统[2-4]中，H2S作为一种神经调质存在，并且其代谢紊乱可能参与包括PD在内的多种神经退行[5]50性疾病的发病过程。外源性给予H2S可减轻反复性热性惊厥诱导的脑损伤。吸入型H2S及其供体硫氢化钠（NaHS）通过抑制炎症反应和氧化应激对鱼藤酮等毒素诱导的PD模型[6-11]动物发挥神经保护作用。。这一系列研究都表明H2S是一种重要的内源性气体信号分子，有望成为神经疾病治疗的新靶标。但是，目前对H2S的神经生物学功能的认识还不够全面，尤其是H2S与神经再生的相55关性研究较少。因此，探索H2S在神经再生中的可能作用及其机制具有重要的学术价值。[12]研究发现H2S能调节神经元和胶质细胞内钙浓度。而且，H2S可通过上调缺氧诱导因子-1[13]和血管内皮生长因子水平而在促血管新生中发挥重要作用，这些细胞因子都参与了神经再生的调节。因此，我们推测H2S可能对神经干细胞的增殖、分化等有调节作用。神经再生是指神经干细胞增殖、分化、迁移，并整合入神经环路中生成功能性神经元的[14]60过程。目前的研究认为持续的神经再生主要存在于海马齿状回颗粒细胞[14][15](subgranularzone,SGZ)和侧脑室室管膜下区(Subventricularzone,SVZ)。已有文献报道，[16]SVZ区神经再生水平的下调与神经干细胞密切相关。Zuo.F等也发现在，神经干细胞都够[17]一定程度上修复帕金森病模型小鼠中受损的SVZ区。综上所述，H2S和神经再生都是当今神经科学领域的研究热点。但是，两者之间的相关65性，尤其是H2S对成年神经再生是否具有作用尚未阐明。本研究拟在细胞水平，初步探索外源性H2S在神经再生中的作用及可能机制，为深入系统研究H2S的神经生物学特性及作用，尤其是揭示该气体信号分子在神经再生中的重要意义提供实验基础。1材料与方法701.1材料1.1.1小鼠抗体野生型小鼠C57BL/6J在苏州大学提供的SPF级实验动物中心饲养，本研究使用的为孕14天C57BL小鼠小鼠和C57BL成年小鼠。所有的动物实验操作严格按照苏州大学动物伦理委员会的相关规定执行。小鼠用3.6%的水合氯醛麻醉。751.1.2抗体本研究所用的抗体有Sox2小鼠多克隆抗体，美国R&D公司（货号：MAB2018）；nestin兔多克隆抗体，英国Abcam公司(货号：ab27952)；CBS兔多克隆抗体，美国SantaCruz公司(货号:sc-67154)；CSE小鼠多克隆抗体，abnova公司(货号：H00001491-M03)；Brdu小鼠-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn多克隆抗体，美国covance公司（货号：MMS-139S）。801.2实验方法1.2.1胚胎神经干细胞的培养取孕14天C57BL小鼠，断头后迅速取剖开腹腔取出胚胎，置75%的乙醇中浸泡消毒1-2min，放入无菌生理盐水中，漂洗3次，入超净工作台，用4℃预冷HBSS溶液洗两次，在解剖显微镜下仔细剥离出脑膜和血管，取前脑侧脑室周围组织包含脑室下区SVZ。用解85剖镊将SVZ组织块机械撕碎，加入0.05%的胰酶37℃消化6min后，弃掉胰酶，用HBSS洗2遍，加入培养基（DMEM/F12+2%B27+20ng/mlEGF+20ng/mlbFGF）2ml吹打后筛网过滤，制成单细胞悬液。1000r/min，离心5min，弃上清，加入培养基重悬细胞，用细胞计数5板进行细胞计数。调整细胞密度为1×10/ml，接种于24孔板内，37℃、5%CO2培养箱悬浮培养以后每3天半量换液一次。原代细胞培养约5-7天后形成原代神经球，将原代神经球90移入4ml离心管，加入0.05%的胰酶37℃消化6min后，加入等量的培养基吹打后用筛网过滤,制成单细胞悬液，1000r/min离心5min，去除上清液，加入新鲜的培养基，重悬细胞，5以1×10/ml的细胞密度接种于多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-Ornithine，10mg/ml）及层粘连蛋白（Laminin，5μg/ml）包被过的24孔板内。以后每3天半量换液一次。此后约培养5天后再传代。弃培养基，用PBS洗两次，加0.05%的胰酶消化1min，弃胰酶加培养基重悬细胞，595稀释以1×10/ml的细胞密度接种于多聚鸟氨酸与laminin包被过的24孔板内。此后约培养5天后再传代。弃培养基，用PBS洗两次，加0.05%的胰酶消化1min，弃胰酶加培养基重悬5细胞，稀释以1×10/ml的细胞密度接种于多聚鸟氨酸与laminin包被过的24孔板内。1.2.2细胞免疫荧光将第二代的神经球贴壁培养于包被过的小玻片上（方法同前）；培养过夜后弃培养基，100加入500mlPBS洗两遍每次10min；弃PBS加入4℃预冷的4%多聚甲醛300ml，固定10min；弃固定液，PBS洗涤3次，每次3-5min；弃PBS，每孔加入溶于PBS的1%Triton-X-100200ml，静置10min；吸弃后PBS洗涤3次，每次摇床洗5min；抗体用PBS以适当的浓度配制后（nestin稀释度：1：1000，Sox2稀释度1：200，CBS稀释度：1：200，CSE稀释度：1:100）孵育处理过的细胞，室温2h；弃一抗后用300mlPBS洗涤3次每次5min，孵育二抗105（1：500），室温孵育1h；弃二抗，PBS洗3-5次，每次10min；用含DAPI的封片剂封片：用激光共聚焦拍片检测。1.2.3Westernblot检测蛋白的表达收集第一代的神经球，离心弃去培养基，用PBS冲洗2次离心，加入100ml细胞裂解液，然后用细胞刮刮下细胞皿上的细胞，收集细胞悬液于离心管中，低温静置震荡30min，1104℃下13200rpm离心15min，取上清。测浓度，在样品中加入4×上样缓冲液混匀，使蛋白质变性。配制12%SDS-PAGE分离胶和5%的SDS-PAGE浓缩胶，待凝固后按次序上样，孵育CBS和CSE抗体，凝胶成像仪进行成像。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.4RT-PCR技术和Q-PCR技术检测mRNA的表达收集第一代的神经球加入1mlTrizol，冰上放置5min。加入氯仿200ml/EP，振荡器震115荡15s，室温静置2-3min。4℃离心，12000rpm，15min，吸取上层氯仿层约500µl，加入等体积异丙醇，轻轻混匀，室温静置10min。4℃离心，12000rpm，10min。倒出上清液，扣干EP管，取沉淀用1ml75%预冰乙醇洗1次，4℃离心，7500rpm，5min。弃去乙醇，干燥后加适量DEPC水（10-20ml/EP管），震荡混匀，55-60℃溶解10min，-70℃保存。检测RNA浓度并进行反转录和目的基因扩增。配制2%琼脂糖凝胶，待凝固后上样，得到120RT-PCR结果。实时荧光定量PCR：实验具体操作根据使用说明书用SYBRGreenIPremixExTaqkit配制反应液，在ABI7500PCR仪上进行。Q-PCR分析的结果由Ct值用2^-△△Ct法计算基因间的表达量差异，以18S为内参照基因，用sham组来标准化。1.2.5Brdu免疫荧光染色取C57BL两月龄小鼠，腹腔注射不同浓度的H2S供体NaHS溶液(1μmol/L、10μmol/L、12550μmol/L、100μmol/L)，每天一次，连续注射5、10天，最后一天给药2小时后按30mg/kg的剂量给C57BL小鼠腹腔注射Brdu，每两小时一次，共四次。末次Brdu给药2小时后处死动物。在此时间段内仅有处于细胞增殖过程中S期的细胞能被Brdu所标记。小鼠灌注取脑固定包埋后按照12μm冰冻切片，从喙侧向尾侧方向收集SVZ（约前囟前1.6mm至前囟后0.6mm）切片，每六张切片取一张用于免疫组化实验。实验方法如下：脑片在室温下130加PBS缓和5min，然后用3%的过氧化氢处理15min。预变性处理：2N盐酸37°C处理30分钟，使DNA变性，暴露DNA中的Brdu抗原。然后将脑片在PBS洗片三次后，用5%BSA/0.3%TritonX-100/PBS室温封闭1小时，加入驴抗小鼠Brdu一抗(抗体稀释度：1:50)4°C过夜。PBS洗片后加入HRP标记的山羊抗小鼠二抗(抗体稀释度1:500)孵育1小时，孵育结束后用PBS洗三次每次10min。洗完后稍微风干，用DAPI染核封片。最后在荧光显微135镜下观察实验结果，每个脑组织选取7个层面统计阳性细胞数。细胞数由photoshopCS6计数软件统计。1.3统计方法使用GraphPadPrism5统计软件对实验中的数据进行统计处理。实验数据以均数±标准误（mean±sem）表示。用t-检验（student’st-test，非配对检验）比较两组数据之间的差异140性，用one-wayanova比较多组数据之间的差异性；p表示显著性值，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，当p<0.05为有统计学意义。2结果2.1体外培养神经干细胞的鉴定显微镜下观察，原代分离的胚胎神经干细胞在12小时内自动聚集成团；到第3天聚集145成圆球形；到了第7天可见呈悬浮生长的由几十个到上百个圆球形细胞组成的神经球，立体感强，表面光滑而透亮。组成细胞球的细胞圆润饱满、活力状态好、细胞间边界清楚，折光性强。传代至多聚鸟氨酸与laminin包被过的24孔板后，细胞可贴壁生长，长出触角。免疫荧光结果显示（图1），分离培养的贴壁细胞表达干细胞表面标记物nestin(绿色信号)，同时-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表达核蛋白Sox2（红色信号），且阳性信号占绝大多数，说明此种方法可以获得纯度较高的150神经干细胞，可用于后续离体实验。图1.免疫荧光双标法鉴定原代培养的神经干细胞Nestin/Sox2(40,Scalebar=20mm)。Figure1.Immunofluorescencelabelingmethodforidentificationofprimaryculturedneuralstemcells.2.2硫化氢合成酶CBS的表达155通过成年C57BL小鼠SVZ区的免疫荧光染色的结果(图2A)，可以观察到硫化氢合成酶CBS（绿色信号）与干细胞的标记物Nestin（红色信号）有共定位，即在成年神经干细胞胞浆内有CBS的表达。同时，贴壁生长的神经干细胞通过免疫荧光染色的方法也可以检测到CBS在神经干细胞胞浆的表达（图2B）。以高表达CBS的BV2细胞及大鼠的肾脏组织作为阳性参照，通过RT-PCR（图2C）及western-blot（图2D）的方法也进一步证实分离培养160的胚胎神经干细胞表达CBS。这些结果一致表明小鼠胚胎生长分化发育的过程中，SVZ区神经干细胞均表达CBS。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn165图2.硫化氢合成酶CBS的表达鉴定。A.免疫荧光双标法鉴定成年C57BL小鼠SVZ区CBS/Nestin(20,Scalebar=20m;63,Scalebar=20m)。B.免疫荧光双标法鉴定原代神经干细胞CBS/Nestin(20,Scalebar=50m;100,Scalebar=50m)。C.D.RT-PCR与western-blot鉴定CBS的表达。Figure2.ThedetectionofhydrogensulfidesynthaseCBS.1702.3硫化氢合成酶CSE的表达通过上述类似的免疫荧光染色，成年C57BL小鼠SVZ区未检测到CSE的阳性表达。然而，C57BL小鼠胚胎E14天脑组织切片中可以观察到CSE（红色信号）与Nestin（绿色信号）的共定位，提示在小鼠胚胎期，神经干细胞表达CSE(图3A)。同时，贴壁培养的胚胎神经干细胞通过免疫荧光染色的方法也检测到硫化氢合成酶CSE的表达(图3B)，以高表175达CSE的Raw264.7细胞作为阳性参照，用RT-PCR（图3C）及western-blot（图3D）的方法进一步确认CSE的表达。而且，通过定量PCR的方法我们发现，胚胎神经干细胞内CBSmRNA的含量约是CSE的3倍（图3E）。这些结果提示，在胚胎发育过程中CSE表达可能逐渐减少，在成年体内表达难以检测到，这与文献报道的哺乳动物全脑组织能检测到CSEmRNA而未检测到蛋白表达相一致，进一步提示在成年神经系统中CBS可能是H2S的主要180合成酶。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn185图3.硫化氢合成酶CSE的表达鉴定。A.免疫荧光双标法鉴定胚胎E14天C57BL小鼠CSE/Nestin(20,Scalebar=100m)。B.免疫荧光双标法鉴定原代神经干细胞CSE/Nestin(100,Scalebar=10m)。C.D.RT-PCR与western-blot鉴定CSE的表达。E.Q-PCR方法测定CBS与CSE的相对含量（*P<0.05，n=3）。Figure3.ThedetectionofhydrogensulfidesynthaseCSE.2.4成年C57BL小鼠的体内增殖实验190通过细胞水平的实验我们发现H2S的合成酶CBS和CSE在神经干细胞中表达，为进一步探究外源性H2S是否能够促进神经干细胞的增殖，本研究通过腹腔注射不同剂量的H2S供体NaHS，每天注射一次，连续注射5、10天，以Brdu免疫荧光染色观察C57BL成年小鼠SVZ区的细胞增殖（图4A），红色信号为Brdu阳性信号。由图可见，在一定剂量范围内随NaHS剂量升高Brdu阳性细胞明显增多，50mmol/L时作用最明显（图4B）。另外，随H2S作用195时间的延长，Brdu阳性细胞明显增多（图4C）。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4.C57BL小鼠SVZ区Brdu免疫荧光染色（Scalebar=160mm）（***P<0.001,n=10）。Figure4.TheimmunofluorescencestainingofBrduinSVZofC57BLmouse.2003结论本研究证实前脑侧脑室周围组织包含脑室下区SVZ存在神经再生现象。并且发现硫化氢合成酶CBS及CSE在SVZ区神经干细胞在体和离体中均有表达，CBS的表达量明显高于CSE。另外，本研究证实外源性硫化氢NaHS能够促进成年鼠神经干细胞的增殖。4讨论205研究表明神经干细胞增殖及向各种神经细胞分化过程先后经历了几个阶段：神经干细胞、神经祖细胞、神经母细胞、未成熟神经细胞和成熟神经细胞。神经干细胞增殖、分化过程中出现了多种表面标志性抗原，如神经干/祖细胞表达巢蛋白（nestin）、Musashi.1和Sox2-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn等；迁移和分化中的神经母细胞表达双皮质素(doublecortin，DCX)、唾液酸神经细胞黏附分子(polysialicacidneuralcelladhesionmolecule，PSA-NCAM)等；分化早期未成熟的神经元210表达神经元特异性微管蛋白Ⅲ(neuronicspecifictubulinⅢ，TUJl)等；分化成成熟神经元后表达神经元特异性核蛋(neuronspecificnuclearprotein，NeuN)等。Nestin属于第Ⅵ类中间丝蛋[18]白，几乎在所有神经干/祖细胞中均有表达，是检测神经干细胞的理想标记物。Sox2是一种高迁移率组DNA结合蛋白，表达于细胞核，在小鼠个体发育从胚胎到成年的整个阶段都表达。成年期来自神经系统的神经发生区域的组织培养形成的神经球都表达Sox2。因而，[19]215它也被看作是一种神经干细胞的标记物。研究显示，Sox2可能参与神经干细胞的自我更新和分化。小鼠Sox2缺失在出生时仅表现为轻微的脑损伤，然而发育过程中会出现海马神[20]经发生完全缺失，齿状回发育不全。根据文献报道，CSE在脑中几乎没有表达，但IsaoIshii等通过Northern印迹杂交发现[21]CSE在脑内的转录产物，但在蛋白水平没有检测到CSE的活性。我们在体外培养的神经220干细胞中检测到了CSE的表达，且CBS的mRNA水平是CSE的3倍。这进一步证实了CBS是脑内主要的硫化氢合成酶。通过胚胎脑组织及成年脑内CBS与CSE的鉴定，我们发现CBS在胚胎脑组织中有高表达且在胚胎成熟后脑内仍有较高表达，而CSE在胚胎脑组织中有表达，但随胚胎发育表达逐渐减少，在成体动物脑内几乎没有表达。这些结果提示我们，在胚胎期CBS和CSE可能都参与脑内H2S的生成，而在成年期CBS可能是脑内H2S的主225要合成酶。H2S作为气体信号分子，可以以单纯扩散方式进入血脑屏障，无需借助任何通道或载体[22,23]蛋白。实验研究H2S的生物学效应时主要用的是H2S饱和溶液及H2S供体NaHS。已[6,有大量研究证明NaHS作为H2S速释供体，不仅能够在帕金森病模型中发挥神经保护作用7][24][25]，在心肌损伤及肾脏老化模型中也能通过抑制氧化应激缓解疾病损伤。Liu,D.等也证[26]230实NaHS能够促进海马齿状回区神经干细胞增殖，但是NaHS是否能影响SVZ区神经干细胞的增殖目前尚不明确。本研究证实通过给予外源性硫化氢NaHS，促进了成年小鼠SVZ区神经干细胞的增殖，但具体机制尚不明确，有待进一步研究探索。[参考文献](References)235[1]Goodwin,L.R.,etal.,Determinationofsulfideinbraintissuebygasdialysis/ionchromatography:postmortemstudiesandtwocasereports.JAnalToxicol,1989.13(2):p.105-9.[2]Hu,L.F.,etal.,Hydrogensulfide:neurophysiologyandneuropathology.AntioxidRedoxSignal,2011.15(2):p.405-19.[3]Wang,M.,etal.,Hydrogensulfidefunctionsasaneuromodulatortoregulatestriatalneurotransmissionina240mousemodelofParkinson"sdisease.JNeurosciRes,2015.93(3):p.487-94.[4]Nagpure,B.V.andJ.S.Bian,Brain,Learning,andMemory:RoleofH2SinNeurodegenerativeDiseases.HandbExpPharmacol,2015.230:p.193-215.[5]Han,Y.,etal.,Hydrogensulfidemayimprovethehippocampaldamageinducedbyrecurrentfebrileseizuresinrats.BiochemBiophysResCommun,2005.327(2):p.431-6.245[6]Hu,L.F.,etal.,NeuroprotectiveeffectsofhydrogensulfideonParkinson"sdiseaseratmodels.AgingCell,2010.9(2):p.135-46.-9- 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