羧甲基壳聚糖基胶束的制备工艺及其缓释性研究.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn羧甲基壳聚糖基胶束的制备工艺及其缓释#性研究12**戴一星，郎美东5（1.华东理工大学药学院，上海200237；2.华东理工大学材料科学与工程学院，上海200237）摘要：本文以羧甲基壳聚糖接枝聚己内酯（CMCS-g-PCL）作为抗血管类药物阿帕替尼的载体，从载药量和包封率角度分别研究了乳化/挥发法、透析法以及薄膜水化法制备载药胶束的效果，发现乳化/挥发法最适合用于制备载药胶束。制备所得的载药胶束的平均粒径在10110-150nm，体外释放实验表明载药胶束具有良好的缓释效果，在72h内释放了37%-55%的药物。细胞毒性实验证明载药胶束对人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的抑制效果随着培养时间推移逐渐增大，有利于实现长效治疗。关键词：药剂学；羧甲基壳聚糖接枝聚己内酯；阿帕替尼；胶束制备；缓释中图分类号：R944文献标识码：A15StudyonPreparationProcessandSustainedReleaseofCarboxymethylChitosanBasedMicelles12DAIYixing,LANGMeidong(1.SchoolofPharmacy,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237;2.SchoolofMaterialsScienceandTechnology,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,20Shanghai200237)Abstract:Inthispaper,carboxymethylchitosan-graft-polycaprolactone(CMCS-g-PCL)wasselectedasthecarrierofapatinib.Emulsification/volatilizationmethod,dialysismethodandfilmhydrationmethodwereusedonthepreparationofdrug-loadedmicelles,andemulsification/volatilizationmethodwasprovedtobethebestmethodasithasthehighestdrugloadingcontents(DLC)andencapsulation25efficiency(EE).Thepreparedmicellesweretheparticlesizesofapproximately110-150nmwithagoodsustained-releaseeffectwhichreleased37%-55%drugswithin72hoursasindicatedbyinvitroreleaseexperiments.Cytotoxicitytestshowedthattheinhibitoryeffectofdrug-loadedmicellesonhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVECs)graduallyincreasedwiththeincreaseofculturetime,whichwasbeneficialtolong-termtreatment.30Keywords:pharmaceutics;carboxymethylchitosan-graft-polycaprolactone;apatinib;micelles’preparation;sustained-release0引言1971年，Folkman发现血管生成在肿瘤生长以及转移中发挥重要的作用，阻碍血管生成[1]35或许能成为阻止肿瘤生长的一个有效手段。其机理是在肿瘤组织附近会不断形成新生的血[2]管，这些血管可为肿瘤组织提供氧气和营养，以满足它的增殖，生长和转移，阻断肿瘤血基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130074110007）作者简介：戴一星（1992-），男，硕士研究生，主要研究方向：药物缓控释制剂通信联系人：郎美东（1966-），男，教授,主要研究方向：生物材料.E-mail:mdlang@ecust.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn管的生成即可阻止氧气和营养物质的运输。此后，在肿瘤治疗领域，人们越来越关注血管生[3-5]成的研究。阿帕替尼（Apatinib）作为中国自主研发的小分子抗血管药物，在临床使用中明显延长[2]40了晚期胃癌、肺癌和结肠癌病人的生存期。但是Apatinib在使用中也存在着很多的副作用，包括高血压、蛋白尿、手足综合征等。而产生这些副作用的主要原因是Apatinib不仅会靶向肿瘤附近的血管，也会对微血管比较密集的区域如粘膜、手足末端等部位产生靶向，造成正[6]常组织的损伤。同时，有研究称抗血管类药物如果反复停药，会诱发肿瘤转移。因此，有必要设计出一种新型的制剂来改善其副作用、提高疗效，并实现可持续性治疗。近年来，纳[7-9]45米类药物载体因其良好的性能，成为药剂学领域的研究热门，这也为我们的研究提供了思路。羧甲基壳聚糖接枝聚己内酯（CMCS-g-PCL）是利用羧甲基壳聚糖（CMCS）作为引发[10]剂开环己内酯（CL）形成的新型的两亲性接枝聚合物，可在水溶液中自组装形成胶束。[11-12]因为CMCS本身具有抗肿瘤及抗血管活性，所以拟采用CMCS-g-PCL作为药物载体，50包载Apatinib，以期达到一个更好的协同治疗的效果。[13][14]聚合物胶束的制备方法有很多种，常见的物理包埋法有透析法、乳化/挥发法以及[15]薄膜水化法，不同的制备方法对聚合物胶束的制备效果存在显著差异，因此选择合适的制备胶束的方式十分重要。本文从胶束载药量及包封率等方面研究了三种胶束制备方法之间的差异，并选择出最合适的制备方法。然后选取了合适的释放介质，研究了载药胶束的体外55释放效果，最后研究了载药胶束对HUVECs的细胞毒性，着重研究了培养时间与细胞毒性之间的关系。1实验部分1.1实验原料及仪器1.1.1实验原料60CMCS-g-PCL：自制，利用CMCS的-OH开环CL得到，根据质量投料比分为CMCS-g-PCL(1:2.9)、CMCS-g-PCL(1:6.9)、CMCS-g-PCL(1:10.9)三种，简称CP-2、CP-6、CP-10；二氯甲烷、甲醇、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氢呋喃（THF）、十二烷基硫酸钠（SDS）、吐温-80：分析纯，上海泰坦科技股份有限公司；阿帕替尼：2g，江苏恒瑞医药股份有限公司；人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、内皮细胞培养基（ECM）、胎牛血清65（FBS）、内皮细胞生长补充物（ECGS）、盘尼西林/链霉素（P/S）：ScienceCell(USA)；重组人血管内皮细胞生长因子165(rhVEGF165)：南京金斯瑞生物科技公司；CCK-8试剂盒：日本同仁化学研究所。1.1.2实验仪器超声波隔音箱：GA92-II型，无锡市上佳生物科技有限公司；恒温震荡培养箱：HZP-15070型，上海精宏实验设备有限公司；紫外-可见分光光度仪：SP-1900，上海光谱仪器有限公司；全波长扫描酶标仪：SpectraMax190型，美国MolecularDevices公司。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2载药胶束的制备图1CMCS-g-PCL载药胶束自组装示意图75Fig.1SchematicstructureofdrugloadedCMCS-g-PCLmicellesthroughself-assemblyprocess如图1，CMCS-g-PCL作为两亲性的共聚物，可以在水中自组装形成以CMCS为外壳、PCL为内核的聚合物胶束，通过疏水相互作用可将疏水药物包载入胶束的内核。1.2.1乳化/挥发法首先，称取10mg聚合物和适量Apatinib溶于不溶于水的混合有机溶剂（V二氯甲烷:V甲醇80=3:1）（二氯甲烷用于溶解聚合物而甲醇用于溶解Apatinib）中，加入适量水，形成油水相分层的溶液。在超声波隔音箱中超声乳化（于250W功率下超声60s停15s，重复4次）后置于圆底烧瓶中旋蒸除去有机溶剂，再置于截留分子量3500（MWCO=3500）的透析袋内在以去离子水/PBS为外液相的溶液中透析5h除去残留的有机溶剂，经0.45μm滤头过滤除去未包载的药物，最终得到Apatinib/CMCS-g-PCL(CPA)载药胶束，冻干后可得CPA胶束85粉末。1.2.2透析法首先，称取10mgCMCS-g-PCL及适量Apatinib溶于2.5mLDMF中，将配置好的溶液吸入到注射器中，缓缓滴入到不断搅拌的去离子水/PBS中，滴加结束后继续保持搅拌2h。然后将溶液置于MWCO=3500的透析袋中，于去离子水/PBS中透析24h，中间换水5次，90经0.45μm滤头过率除去未包载进去的药物即可得到CPA胶束。1.2.3薄膜水化法首先，称取10mgCMCS-g-PCL及适量Apatinib溶于二氯甲烷、THF等易挥发的溶液中，转移到圆底烧瓶内，用旋转蒸发仪旋蒸至瓶底形成一层很薄的聚合物薄膜。向圆底烧瓶内加入10mL去离子水/PBS，于50℃水浴下搅拌5h，或超声助溶，观察分散以及胶束成型95的效果。1.3载药胶束的表征1.3.1胶束粒径（d,nm）、粒度分布（PDI）的测定采用Nano-ZSNanosizer仪器（Malver公司）进行动态光散射测定。测试光源为氦-氖-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn激光光源，温度为25℃，散射角为173°，波长设定为633nm。1001.3.2CPA载药胶束的包封率（EE）和载药量（DLC）的测试首先配置几组不同浓度梯度的Apatinib/DMF溶液，用紫外分光光度计测定其特征吸收波长及标准曲线。取冷冻干燥结束后的载药胶束，用DMF溶液溶解，配置成一定浓度的溶液，之后测定其在特定波长下的吸收峰强度，并与药物在DMF溶液中的标准曲线对比，最终通过计算可得到载药胶束中药物的质量。包封率及载药量的计算公式如下：载入的药物质量105EE(%)=×100%(1)投药量载入的药物质量DLC（）%=×100%(2)载入的药物质量聚合物质量+1.4载药胶束的体外释放1.4.1释放介质的选择因为Apatinib是极难溶于水的药物，在PBS中亦是如此。因此做体外释放实验时，为110了满足漏槽条件（药物在释放介质中的浓度远小于其饱和浓度），外液相不能为纯PBS，需要加入一些其它物质，增加Apatinib在溶液中的溶解性。这里选择了两种较为常见的增溶剂：SDS和吐温-80。分别配置0.2wt%SDS,0.5wt%SDS,0.2wt%吐温-80,0.5wt%吐温-80的PBS（pH7.4）四种溶液。称取10mgApatinib分别加入到50mL配好的四种溶液中，搅拌0.5h后观察药物溶解情况。1151.4.2标准曲线的绘制首先确定Apatinib在释放介质中的特征吸收波长，然后配置一系列浓度梯度的溶液，于特征吸收波长处测定吸光度，并绘制出标准曲线。1.4.3释放实验首先制备10mL1mg/mL的不同接枝率为载体的CPA胶束溶液，取出2mL冻干测定120载药量及包封率，其余8mL溶液加入透析袋中，将透析袋两端封紧后浸入50mL外液相中。另外，作为对照样，取同样量的Apatinib直接溶于释放介质，加入到透析袋内，置于外液相。然后在37℃、100rpm振速的恒温振荡箱中振荡。之后每隔一定时间，从外液相中取出5mL溶液，同时补入5mL的新鲜溶液。对于取出的样品溶液，测试其在特征吸收波长处的吸光强度，对比Apatinib在释放介质中的标准曲线，可得到该时间，外液相药物浓度。对于每个125测试点，均进行3次重复取样。1.5细胞毒性研究1.5.1细胞培养HUVECs在37℃含有5%CO2的震荡培养箱的补充有5%FBS,1%ECGS和1%P/S的ECM中培养。每1-2天传代一次，细胞传代不超过7次。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1301.5.2载药胶束对细胞增殖的抑制作用HUVECs接种于96孔板，调节细胞浓度，使每孔细胞数为5000个，然后在空白的培养基中挨饿12h。之后不同浓度不同接枝率的CPA胶束和纯药Apatinib加入到含有100ng/mLrhVEGF165的培养基中，在37℃含有CO2的环境下共同培养48h后，向各孔加入10uLCCK-8溶液，于细胞培养箱内培养4h后用酶标仪测量各孔在450nm、600nm处的OD135值。对于缓释性验证实验中，分别于12h、24h、36h、48h、72h加入CCK-8溶液，测定OD值；以450nm处的OD值减去600nm处的OD值作为每孔的OD净值。没有任何细胞的纯基质组以及加入rhVEGF165的细胞组分别作为空白和控制组。胶束以及纯药的细胞增殖率（CellProliferationRate）及细胞抑制率（CellInhibitoryRate）采用如下公式计算：OD−OD样品空白CellProliferationRate(%)=×100%(3)OD−OD控制空白OD−OD样品空白140CellInhibitoryRate(%)=×1-100%(4)OD−OD控制空白2结果与讨论2.1载药胶束的制备2.1.1胶束制备方法对比首先，需要绘制出Apatinib在有机溶剂DMF中的标准曲线，以便测定包封率及载药量。145对Apatinib/DMF溶液进行全波长扫描，如图2(a)，Apatinib在347nm处有吸收峰。因此选取347nm作为特征吸收波长进行药物的标准曲线绘制。标准曲线为A=0.02136C+0.00116,R=0.99977，相关度好。图2Apatinib/DMF溶液的全波长扫描（a）和Apatinib/DMF溶液的标准曲线（b）150Fig.2FullwavelengthscanningofApatinib/DMF(a)andThestandardcurveofApatinib/DMF(b)设置投药量为25%，以各接枝率CMCS-g-PCL为载体，采取不同方式制备载药胶束，表1为乳化/挥发法制得胶束的载药情况。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn155表1乳化/挥发法制得的CPA载药胶束载药情况Table1TheencapsulationrelatedparametersonCPAmicellesSamplesEE(%)DLC(%)CPA-261.7313.37CPA-677.1816.17CPA-1075.8515.94从表1可以看出，CPA-2载药胶束的包封率较低，其余两组包封率都在70%以上。这是因为CPA-2组的载体疏水内核较小，包载效果较差，而CPA-6和CPA-10都有较大的疏水内核。160表2透析法制得的CPA胶束的载药情况Table2TheencapsulationrelatedparametersonCPAmicellespreparedbydialysismethodSamplesEE(%)DLC(%)CPA-232.187.45CPA-645.3210.18CPA-1050.4612.01表2是透析法制得胶束的载药情况。与乳化/挥发法比较不难发现，包封率和载药量明显较低，而且在制备的过程中，透析结束时，有少量的聚合物或者药物析出，所以可能CPA载药胶束不适合用透析法来制备。另外，包封率和载药量低的另一重要原因是透析法在透析165的过程中，因为时间较长，透析过程也可看作是药物释放的过程，所以会有部分本身已经载入胶束的药物被透析出来。最后，采取了薄膜水化法制备胶束，发现三组聚合物在成膜后的水化过程中，结果都不太理想，即使水化时采取超声助溶，接枝度最低、亲水性较好的CPA-2组聚合物的水化效果也不理想。原因是该法对两亲性聚合物本身的水溶性有较高要求，聚合物必须具有较高的170亲水亲油平衡值（HLB），而CMCS-g-PCL达不到这一要求，因此不适合采取此方法。综合以上结果，乳化/挥发法适合用于制备CPA载药胶束，且在投药量为25%时，载药量和药物利用率高。2.1.2载药胶束粒径测试175图3不同接枝率CPA载药胶束的DLS粒径分布图Fig.3DLSparticlesizedistributionofCPAmicelleswithdifferentgraftingratio载药胶束的粒径分布如图3所示，其平均粒径大致分布在110nm到150nm之间，且随-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn着内核PCL量的增加，粒径增大，具体数值见表3。该纳米尺寸的聚合物胶束具有EPR效[16]应，即被动靶向性，载药胶束能够富集于肿瘤组织周围从而更好地发挥疗效。180表3不同接枝率CPA胶束的粒径Table3TheparticlesizeofCPAmicelleswithdifferentgraftingratioSamplesAveragesize(nm)PDICPA-2113.10.099CPA-6127.30.116CPA-10145.50.0882.2药物释放2.2.1标准曲线绘制185图4Apatinib在0.2wt%SDS的PBS中的全波长扫描（a）和Apatinib在0.2wt%SDS的PBS中的标准曲线（b）Fig.4FullwavelengthscanningofapatinibinPBS(including0.2wt%SDS)(a)andthestandardcurveofapatinibinPBS(including0.2wt%SDS)(b)190阿帕替尼粉末在上述四种溶液中搅拌0.5h后发现：仍有粉末悬浮在0.2wt%吐温-80及0.5wt%吐温-80的PBS溶液中，而能完全溶解在0.2wt%SDS和0.5wt%SDS的PBS溶液中。因此选择0.2wt%SDS的PBS溶液为释放介质，可以满足漏槽条件。称取适量Apatinib粉末溶解在适量体积的0.2wt%SDS的PBS溶液中，对其进行全波长扫描，得到图4(a)。可以看出，Apatinib主要存在两个吸收峰，分别在259nm和343nm195处，而259nm处的吸光度更大，且溶液对它没有干扰，故选择259nm为特征吸收波长进行-4标准曲线绘制。标准曲线为A=0.03771C+6..6×10，R=0.99994。2.2.2体外释放实验从释药曲线图可以看出，在开始的4h内，由于载入的药物有少量处于亲水端或者处于接近亲水端的疏水端，导致药物的释放存在一个轻微的突释现象。在接下来的4-60h内，200药物释放逐渐变缓，这一阶段的药物释放模式主要是药物通过胶束的孔洞渗透而被释放出来。对比三组载药胶束的释放情况可以发现，随着PCL接枝度的增加，释放速度以及最终的释放百分率都有减小的趋势，这是因为内核越大药物被包封越紧密。72h后分别释放了53.24%，41.44%，37.12%的药量。释药60h后，释药曲线就接近于平稳，剩余药物可能要通过聚合物材料缓慢的降解过程释放出来，此为药物释放模式的第三阶段。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn205图5CPA胶束在0.2wt%SDS的PBS（pH7.4）中1-72h的释药曲线Fig.5CumulativereleaseprofileofapatinibfromCPAmicellesinPBS(pH7.4,including0.2wt%SDS)ateachtimepoint(1-72h)而纯药物apatinib在16h内释放量就超过80%，对比发现，载药胶束很好地延缓了210apatinib的释放。该实验表明了CPA载药胶束具有良好的缓释性，可以增加药物在体内的作用时间，实现一个长效治疗效果，避免了不断用药带来的麻烦以及副作用。2.3细胞毒性实验CCK-8法用来测试CPA胶束对HUVECs的细胞毒性（图中浓度指的是胶束中含有的药物的浓度）。从图6(a)可以看出，培养48h后同浓度下纯药组的细胞抑制率要高于载药胶215束组（空白材料未对HUVECs表现出毒性）。这是因为CPA组释放药物需要一个过程，并不能在48h内释放出全部的药物。图6CCK-8法测得的不同浓度的纯药Apatinib和CPA-2,CPA-6,CPA-10胶束与HUVECs共培养48h后220的细胞抑制率（a）；12.5μg/mL的纯药Apatinib和CPA-2,CPA-6,CPA-10胶束与HUVECs共培养时间与细胞抑制率的关系图（b）Fig.6CellinhibitoryrateofdifferentconcentrationofApatinib,CPA-2,CPA-6andCPA-10micellesinHUVECsbyusingCCK-8assayafterincubationfor48h(a);Therelationshipbetweencellinhibitoryrateandincubationtimeof12.5μg/mLofApatinib,CPA-2,CPA-6andCPA-10micellesinHUVECs(b)225图6(b)是培养时间与细胞抑制率的关系图。从图中可以发现：纯药Apatinib在共培养12h时就表现出了40%以上的细胞抑制率，而三组载药胶束都在20%以下；随着培养时间的增加，细胞抑制率也越来越高，区别在于纯药的细胞抑制率起始就很高，随后的抑制率增-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn高的速度不快，而载药胶束组随着培养时间的增加，药物逐渐释放出来，表现出较快速度的抑制率的增长；当培养时间达到72h时，三组载药胶束组因为很好的缓释效果，以及药物230的持续治疗疗效，使得最终的抑制率接近纯药组。考虑到72h后，细胞本身受环境影响较大，实验数据不可靠就没继续研究。另外可以发现，在各时间点，细胞抑制率的大小顺序都是CPA-2>CPA-6>CPA-10，这是因为CPA-2的释药速率要快于CPA-6快于CPA-10，与释药结果一致。以上结果，说明载药胶束能够延缓药物的释放，实现持续长效性治疗；另外，通过调节235载体接枝率的大小，可以调节药效大小。3结论本文给出了三种胶束制备方式在胶束制备效果上的差异，发现乳化/挥发法适合用来制备CPA载药胶束。制备所得的载药胶束对药物起到了很好的增溶作用，粒径分布在110-150nm，具有较好的EPR效应，有利于药物聚集于肿瘤血管附近。CPA胶束对药物的释放起到240了一个很好的缓释作用；体外毒性实验证明载药胶束对HUVECs起到了一个很好的抑制作用，且随着培养时间的增加，药物释放量的增多，细胞毒性逐渐增大，说明CPA胶束可用于长效治疗。致谢本论文获得了高等学校博士学科点专项科研基金（20130074110007）的资助。245[参考文献](References)[1]JUDAHFolkmanMD.Tumorangiogenesis:therapeuticimplications[J].TheNewEnglandJournalofMedicine,1971,285:1182-1186.[2]TIANShu,QUANHaitian,XIEChengying,etal.YN968D1isanovelandselectiveinhibitorofvascular250endothelialgrowthfactorreceptor-2tyrosinekinasewithpotentactivityinvitroandinvivo[J].CancerScience,2011,102(7):1374-1380.[3]ZHUZhenping,WITTEL.Inhibitionoftumorgrowthandmetastasisbytargetingtumor-associatedangiogenesiswithantagoniststothereceptorsofvaseularendothelialgrowthfactor[J].InvestigationalNewDrugs,1999,17(3):195-212.255[4]WUYan,ZHONGZhaojing,HUBERJ,eta1.Anti-vascularendothelialgrowthfactorreceptor-1antagonistantibodyasatherapeuticagentforcancer[J].ClinicalCancerResearch,2006,12(21):6573-6584.[5]QUChunying,ZHENGYing,ZHOUMin,eta1.Valueofbevacizumabintreatmentofcolorectalcancer:Ameta-analysis[J].WorldJournalofGastroenterology,2015,21(16):5072-5080.[6]YANGYunlong,ZHANGYin,IWAMOTOH,etal.Discontinuationofanti-VEGFcancertherapypromotes260metastasisthroughaliverrevascularizationmechanism[J].NatureCommunications,2016,7:12680-12692.[7]PéREZ-HERROE,FERNáNDEZ-MEDARDEA.Advancedtargetedtherapiesincancer:Drugnanocarriers,thefutureofchemotherapy[J].EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics,2015,93:52-79.[8]CABRALH,KATAOKAK.Progressofdrug-loadedpolymericmicellesintoclinicalstudies[J].JournalofControlledRelease,2014,190:465-476.265[9]CICHAI,SINGHR,GARLICHSCD,etal.Nano-biomaterialsforcardiovascularapplications:Clinicalperspective[J].JournalofControlledRelease,2016,229:23-36.[10]ZHANGMengru,XUHeng,LANGMeidong.SynthesizeofCarboxymethylChitosan-graft-Polycaprolactone(CMCS-g-PCL)andthePreparationofMicelles[J].AdvancedMaterialsResearch,2015,1120-1121:909-914.[11]JIANGZhiwen,HANBaoqin,LIHui,etal.Carboxymethylchitosanrepressestumorangiogenesisinvitro270andinvivo[J].CarbohydratePolymers,2015,129:1-8.[12]JIANGZhiwen,HANBaoqin,LIHui,etal.Preparationandanti-tumormetastasisofcarboxymethylchitosan[J].CarbohydratePolymers,2015,125:53-60.[13]ZHENGXiuling,KANBing,GOUMaling,etal.PreparationofMPEG-PLAnanoparticleforhonokioldeliveryinvitro[J].InternationalJournalofPharmaceutics,2010,386(1-2):262-267.-9- 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