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'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#氧化石墨烯诱导再生丝素蛋白成胶1111,2**孟照辉，林乃波，张利梅，刘向阳（1.厦门大学材料学院,物理科学与技术学院,生物仿生及软物质研究院,福建省柔性功能5材料重点实验室,厦门361005；2.新加坡国立大学物理系,新加坡117542）摘要：本文旨在研究二维材料氧化石墨烯诱导丝素蛋白成胶的过程，运用圆二色谱、拉曼、透射电镜、傅里叶转换红外光谱仪、X射线衍射等手段对材料进行了表征。研究表明氧化石墨烯的加入在一定程度上可以加快再生丝素蛋白的成胶，同时也使β折叠含量和结晶度有所10增加。为设计和应用丝素蛋白-氧化石墨烯复合材料提供了依据。关键词：丝素蛋白；氧化石墨烯；成胶中图分类号：063GrapheneOxideInducedGelationofRegeneratedSilk15FibroinMaterials1111,2MENGZhaohui,LINNaibo,ZHANGLimei,LIUXiangYang(1.CollegeofMaterials,ResearchInstituteforBiomimeticsandSoftMatter,FujianProvincialKeyLaboratoryforSoftFunctionalMaterialsResearch,CollegeofPhysicalScienceandTechnology,XiamenUniversity,Xiamen361005,China;202.DepartmentofPhysics,NationalUniversityofSingapore,117542Singapore)Abstract:Theaimofthispaperistostudythegelationprocessofsilkfibroinmaterialsinducedbytwo-dimensionalmaterialgrapheneoxide,whichwerecharacterizedusingcirculardichroism,Ramanspectroscopy,transmissionelectronmicroscopy,fouriertransforminfraredspectroscopyandXraydiffraction.Thegrapheneoxidecanacceleratethesilkfibroingelationinacertainextent,whilethe25betasheetcontentandcrystallinitywerealsoincreased.Itprovidesabasisforthedesignandapplicationofsilkfibroin/grapheneoxidecomposite.Keywords:Silkfibroin;Grapheneoxide;Gelation0引言30丝素蛋白（SF）作为天然高分子蚕丝材料的重要组成部分，因其具有良好的生物相容性、可控的降解速率、优良的力学性能、可化学改性、价廉、来源充足等特点而受到广泛的关注，同时丝素蛋白易于再生成溶液态，使其可加工成多种维度的产品，例如零维纳米微球、[1-3]一维纤维、二维薄膜、三维支架等，应用于食品添加剂、化妆品、药物缓释、生物传感[4-6][7]器、组织工程等领域。丝素蛋白在水溶液中以无规则线团形式存在，处于热力学和动35力学不稳定状态，有自发形成凝胶化的趋势，在一定条件下，无规则结构会自行向稳定的β折叠结构转变，丝素蛋白凝胶的形成受浓度、添加剂、温度、pH值、外界物理作用等因素[8][9][10]影响，通过分子识别、介观掺杂等方式调控成胶过程可以得到具有不同物理化学性质的丝素蛋白凝胶。氧化石墨烯（GO）是石墨烯衍生物的一种，其主体结构是由碳原子连接而成的单原子基金项目：教育部博士点基金（20130121110018）；111计划(B16029)；国家自然科学基金(21404087,U1405226)；福建省科技厅项目(2017J06019,2014H6022,2015J05109)，广东省自然科学基金(2015A030310007)；中组部千人计划项目；厦门大学校长基金(20720160088)作者简介：孟照辉（1990），男，博士生，主要研究方向：生物材料通信联系人：刘向阳（1960），男，教授，博导，主要研究方向：生物仿生，软物质.E-mail:liuxy@xmu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn40层二维平面。GO含有大量的含氧基团，如羟基、羧基、环氧基等，连接在GO的碳原子骨[11][12][13]架平面上及平面边缘，基于此，可利用这些官能团进行功能化修饰、分子识别，同时也可使其在一些分散介质中稳定存在。GO作为二维材料，具有较大的比表面积，与其它[14][15]物质相接触的面积大，可作为物理吸附、化学反应的位点，也可以作为组装的模板或[16][17]衬底。丝素蛋白的成胶是一个成核生长的过程，利用GO可作为丝素蛋白异相成核的45衬底，以及GO表面的官能团，有望调控丝素蛋白的成胶。1实验部分1.1主要原料与仪器设备蚕茧购于广西蚕丝技术有限公司，碳酸氢钠、盐酸、浓硫酸、磷酸、高锰酸钾、双氧水购自西陇化工股份有限公司，溴化锂、石墨粉（325目）购自上海阿拉丁生化科技股份有限50公司，实验过程中全程使用超纯水。仪器设备型号如下：圆二色谱仪AppliedPhotophysicsChirascan，X射线衍射仪Bruker-axs，扫描电子显微镜HitachiSU-70，透射电镜JEM-2100，傅里叶变换红外光谱仪ThermoFisherNicoletiN10，拉曼光谱仪HORIBAHREvolution，紫外-可见近红外光谱仪PerkinElmerLambda750，表面张力测量仪DataphysicsK100。1.2再生丝素蛋白（SF）溶液的制备55制备过程见图1，将表面清理干净的蚕茧剪成碎片，取定量的蚕茧碎片浸泡于0.5%wt的NaHCO3溶液中，煮沸处理30min，并用去离子水洗干净，重复三次后再用温水清洗三次，即可得到脱胶后的丝素蛋白纤维，将脱胶后的丝素蛋白纤维浸泡于9.3MLiBr溶液中，60℃保温4h，将得到的丝素蛋白-LiBr混合溶液转入透析袋（截留分子量3500D）中，放置于去离子水中透析48h，每隔2-4h换一次水，透析完毕后，将得到的溶液10000rpm离60心20min，取上层清液保存于4℃冰箱中备用，最终浓度为7.5%wt。图1丝素蛋白溶液制备示意图Fig.1Schematicillustrationforthefabricationprocessofsilkfibroin.1.3氧化石墨烯（GO）的制备[18]65采用改进的Hummers法制备氧化石墨烯，具体如下：称取3g的石墨（325目）加入到H2SO4/H3PO4(360mL:40mL)混合溶液中，冰浴中搅拌中缓慢分批次加入18g的KMnO4，将搅拌均匀的混合溶液移至50℃的油浴中保温12h，反应结束后自然降至室温。倒入400mL的冰中，混合均匀后加入5mL30%的双氧水，此时混合溶液变为亮黄色。将得到的产品分别用30%的HCl(1×)、乙醇(2×)、超纯水(2×)离心洗涤后装入透析袋中70（8000-14000D）透析两周（每隔一天换一次水）以除去杂质离子，透析完毕的氧化石墨烯分散液经低速离心除去未氧化的石墨，取上层分散液装瓶备用，最终浓度为15mg/mL。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.4氧化石墨烯诱导丝素蛋白成胶实验将原浓度的氧化石墨烯分散液逐步稀释到所需浓度（本实验选取浓度为0、0.25、0.5、1、2mg/mL），超声剥离2h。取一定体积的氧化石墨烯溶液缓慢加入到等体积的再生丝素75蛋白溶液中，缓慢搅拌均匀，空白对照组为去离子水，为验证氧化石墨烯分散介质对丝素蛋白成胶的影响，取氧化石墨烯高速离心后的上清液作为另一对照组。将混合溶液加入不同容器中进行不同的测试。浊度测试所用容器为比色皿（光程10mm），表面张力测试采用塑料培养皿（直径3cm），成胶过程均在25℃下进行。2结果与讨论802.1丝素蛋白溶液与GO的表征图2丝素蛋白溶液（0.1mg/mL）的圆二色光谱Fig.2Circulardichroismspectrumofsilkfibroinsolution图1为再生丝素蛋白溶液（0.1mg/mL）的圆二色光谱谱图，由图可知在195nm处有一85较强的负谱带峰，对应无规卷曲的构象，在218nm处有较弱的负谱带峰，对应于β折叠构象，对比而言无规卷曲的圆二色性比β折叠更强，说明在丝素蛋白溶液中丝素蛋白主要以无规卷曲的形式存在。图3(A)氧化石墨烯的XRD图谱，从图中可以看出氧化石墨烯的2Ɵ=10.2度时有一个较强的衍射峰，根据布拉格反射定律，计算出在2Ɵ=10.2度时，所对应的氧化石墨的层间90距d=6.94Å，而石墨的层间距为d=3.36Å，说明石墨由于氧化作用层间距变大，得到了层-1间距更大氧化石墨。图3(B)为所制备样品的红外光谱图谱，图中可以看出在波数为3200cm-1-1处为OH的伸缩振动峰，在3210cm处为OH的特征宽峰，1720cm处为C=O的伸缩振动-1-1峰，在1640cm处为石墨烯骨架C=C的特征峰，在1210cm处为羧基中C-O的伸缩峰，-1在1040cm处为环氧基C-O-C的伸缩峰，这些所有峰位的出现说明石墨被充分的氧化了，95出现了C=O、C-O、OH、C-O-C等含氧基团。图3(C)为氧化石墨的拉曼光谱，由图可知氧-1-1-1化石墨在波数为1350cm和1580cm各有个散射峰，1580cm为氧化石墨的G峰位置，2是sp杂化的碳峰，单纯的石墨一般只有G峰，当掺杂和氧化后，D峰会相应出现，图中D峰的出现表明石墨被氧化，从而表明成功的制备了氧化石墨。图3（D）为合成的GO透射-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn电镜图，图中可知GO片层呈褶皱状分布，片层折叠。100图3(A)GO的XRD图谱；(B)GO的FTIR图谱；(C)GO的拉曼光谱；(D)GO的TEM图Fig.3(A)XRDpatternofGO;(B)FTIRspectrumofGO;(C)RamanspectrumofGO;(D)TEMimageofGO2.2GO浓度对再生丝素蛋白成胶时间的影响105图4（A）不同浓度的GO导致的再生丝素蛋白成胶过程中的浊度变化；（B）不同浓度的GO导致的丝素蛋白成胶过程中表面张力的变化Fig.4(A)ChangesinturbidityduringthegelationofsilkfibroininducedbydifferentconcentrationGO;(B)ChangesinsurfacetensionduringthegelationofsilkfibroininducedbydifferentconcentrationGO图4（A）为不同含量的GO分散液对丝素蛋白成胶过程中浊度（550nm处）的变化，110图中曲线（左-右）GO浓度分别是2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、GO上清液、0mg/mL，图中可以看出随着GO分散液浓度(0.25-2mg/mL)的增加丝素蛋白成胶时间不断减少，相比于没有添加GO的丝素蛋白溶液，成胶时间显著缩短，图中右下角插图显示为GO浓度对成胶时间的曲线。为了证明GO分散液的分散介质的影响，将GO高速离心后取上清液添加至丝素蛋白溶液中，图中可以看出上清液和空白样的成胶时间大致相同，由于115离心不能保证把所有的GO取出，上清液中会存在少量的GO，从而使开始成胶时间稍有较-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn少。图成胶过程中浊度的变化曲线可以看出，GO的存在可以促进丝素蛋白的成胶，且浓度较高效果较明显（图中右下角插图）。图4（B）为丝素蛋白溶液成交过程中表面张力的变化，由于成胶过程是一个“液-固”转化的过程，在此过程中表面张力会不断变化，所以可以用表面张力的变化反应丝素蛋白成胶120的过程，从图中可以看出，随着时间的增加表面张力不断增大，在某一节点处骤然增大，之后趋于平缓，这一节点即可认为是丝素蛋白成胶开始的起始点，平缓点即是成胶结束点。图中四条曲线反应的是不同浓度的GO分散液对丝素蛋白成胶时间影响的曲线，可以看出GO浓度越高成胶时间越短（图中右下角插图）。1252.3丝素蛋白的成胶过程图5（A）不同时间下的GO-SFFTIR图谱；图（B）不同时间下的GO-SFXRD图谱Fig.5(A)FTIRspectraofGO-SFatdifferenttime;(B)XRDpatternofGO-SFatdifferenttime130图5(A)为GO诱导的丝素蛋白成胶过程中FTIR图谱（GO为2mg/mL）。选取酰胺一-1区1580-1720cm对其进行不同时间下β折叠含量测试，时间为1h、5h、10h、20h的曲线-1-1-1-1-1峰值分别为1641cm、1640cm、1639cm、1633cm、1621cm，表明曲线的峰值不断落在β折叠的波数区间，通过Peakfit软件对曲线进行拟合，可对不同时间段的样品进行β折叠含量的定量计算（图中插图），随着时间的增加样品中的β含量不断增加，未成胶的样135品β折叠含量较低，β折叠含量的变化同时反映了丝素蛋白的成胶过程。图5(B)为不同时间段样品的XRD图谱（GO含量为2mg/mL），图中可以看出时间较短时（小于20h）丝素蛋白未成胶，样品中的结晶度较低，峰位（23〫左右）主要在无定型区域，构象主要还是以无规卷曲为主，随着时间的增加（大于20h），丝素蛋白逐渐成胶，峰位移至20.8°，同时在9.8〫和24.9〫有两个弱峰，这导致其结晶度显著增高，通过peakfit140软件拟合计算出的结果如右上角的插图可以看出，随着时间的增加，丝素蛋白成胶过程中结晶度逐渐增加。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4不同GO浓度对丝素蛋白成胶的影响145图6（A）不同GO浓度的GO-SFFTIR图谱；图（B）不同GO浓度的GO-SFXRD图谱Fig.6(A)FTIRspectraofGO-SFwithdifferentGOconcentration;(B)XRDpatternofGO-SFatdifferentGOconcentration图6（A）为了说明GO的存在是否会影响样品中β折叠的含量，将成胶后加入了不同-1量GO的样品冻干后对其进行红外测试，截取酰胺一区1580-1720cm，对其进行peakfit拟150合，β折叠计算量如下部插图所示，图中可以看出随着GO的添加量的增加样品中β折叠含量有所增加。图6（B）表示GO浓度对最终样品结晶度的影响，由图可知随着GO浓度的增加最终样品的结晶度也有所增加。这可能与GO与丝素蛋白官能团之间的相互作用与GO的衬底作用有关。2.5GO-SF复合支架SEM表征155图7GO-SF冻干样的SEM图Fig.7SEMimageofFreezedriedGO-SF图7A-D表示GO加入浓度从0.25、0.5、1、2mg/mL的GO-SF冻干样品的SEM图片，由图可知随着GO加入浓度的提高，样品形貌从网络结构逐步过渡成片层结构，且片层越来-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn160越大，这可能由于加入的GO越多，诱导丝素蛋白成胶的衬底越多的缘故。3结论本文通过探究二维材料氧化石墨烯对丝素蛋白成胶的过程，明确了氧化石墨烯可以促进丝素蛋白成胶，并对样品进行了β折叠含量和结晶度定量计算，得出氧化石墨烯的加入会在一定程度上增加β折叠含量和结晶度，并且会诱导大尺寸复合片层结构的生成。165[参考文献](References)[1]MitropoulosAN,PerottoG,KimS,etal.SynthesisofSilkFibroinMicro‐andSubmicronSpheresUsingaCo‐FlowCapillaryDevice[J].AdvancedMaterials,2014,26(7):1105-1110.[2]TuH,YuR,LinZ,etal.ProgramingPerformanceofWoolKeratinandSilkFibroinCompositeMaterialsby170MesoscopicMolecularNetworkReconstruction[J].AdvancedFunctionalMaterials,2016,26(48):9032-9043.[3]WangH,LiuXY,ChuahYJ,etal.Designandengineeringofsilkfibroinscaffoldswithbiomimetichierarchicalstructures[J].ChemicalCommunications,2013,49(14):1431-1433.[4]XieM,FanD,ChenY,etal.Animplantableandcontrolleddrug-releasesilkfibroinnanofibrousmatrixtoadvancethetreatmentofsolidtumourcancers[J].Biomaterials,2016,103:33-43.175[5]KunduB,RajkhowaR,KunduSC,etal.Silkfibroinbiomaterialsfortissueregenerations[J].Advanceddrugdeliveryreviews,2013,65(4):457-470.[6]DiaoYY,LiuXY,TohGW,etal.Multiplestructuralcoloringofsilk‐fibroinphotoniccrystalsandhumidity‐responsivecolorsensing[J].AdvancedFunctionalMaterials,2013,23(43):5373-5380.[7]IizukaE,YangJT.Opticalrotatorydispersionandcirculardichroismofthebeta-formofsilkfibroinin180solution[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,1966,55(5):1175-1182.[8]MatsumotoA,ChenJ,ColletteAL,etal.Mechanismsofsilkfibroinsol−geltransitions[J].TheJournalofPhysicalChemistryB,2006,110(43):21630-21638.[9]LinN,LiuXY,DiaoYY,etal.Switchingonfluorescentemissionbymolecularrecognitionandaggregationdissociation[J].AdvancedFunctionalMaterials,2012,22(2):361-368.185[10]LinN,MengZ,TohGW,etal.Engineeringoffluorescentemissionofsilkfibroincompositematerialsbymaterialassembly[J].Small,2015,11(9-10):1205-1214.[11]DreyerDR,ParkS,BielawskiCW,etal.Thechemistryofgrapheneoxide[J].ChemicalSocietyReviews,2010,39(1):228-240.[12]WangS,CazellesR,LiaoWC,etal.MimickingHorseradishPeroxidaseandNADHPeroxidaseby190HeterogeneousCu2+-ModifiedGrapheneOxideNanoparticles[J].NanoLetters,2017,17(3):2043-2048.[13]SunH,RenJ,QuX.CarbonnanomaterialsandDNA:Frommolecularrecognitiontoapplications[J].Accountsofchemicalresearch,2016,49(3):461-470.[14]YangK,ChenB,ZhuX,etal.Aggregation,Adsorption,andMorphologicalTransformationofGrapheneOxideinAqueousSolutionsContainingDifferentMetalCations[J].EnvironmentalScience&Technology,2016,19550(20):11066-11075.[15]QuK,ZhengY,DaiS,etal.Grapheneoxide-polydopaminederivedN,S-codopedcarbonnanosheetsassuperiorbifunctionalelectrocatalystsforoxygenreductionandevolution[J].NanoEnergy,2016,19:373-381.[16]ZhouX,HuangX,QiX,etal.Insitusynthesisofmetalnanoparticlesonsingle-layergrapheneoxideandreducedgrapheneoxidesurfaces[J].TheJournalofPhysicalChemistryC,2009,113(25):10842-10846.200[17]NguyenAT,HuangQL,YangZ,etal.Crystalnetworksinsilkfibrousmaterials:fromhierarchicalstructuretoultraperformance[J].Small,2015,11(9-10):1039-1054.[18]MarcanoDC,KosynkinDV,BerlinJM,etal.Improvedsynthesisofgrapheneoxide[J].ACSnano,2010,4(8):4806-4814.-7-'