脑心通胶囊干预局灶性脑缺血大鼠基因表达谱研究.pdf 19页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn脑心通胶囊干预局灶性脑缺血大鼠基因表#达谱研究11,211**胡燕，刘欣，王学习，李晓彬5（1.兰州大学基础医学院中西医结合研究所；2.中国中医科学院中药研究所）摘要：目的：确定与脑心通胶囊抗脑缺血作用相关的基因及蛋白。方法：通过基因芯片技术及相关数据分析，初步筛选出脑心通胶囊干预局灶性脑缺血大鼠的相关基因，并运用Q-PCR10结合免疫组化实验进行验证，从而明确脑心通胶囊干预局灶性脑缺血大鼠相关基因、蛋白变化情况。结果：通过数据分析，筛选出脑心通胶囊干预的基因17个，排除未标注和响应值低的基因，剩余基因11个。对其进行Q-PCR验证分析发现，与MCAO组比较，MCAO_D组倍数增加基因有Ccnd2、Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Qrich1、Rps4y2，有显著性差异的为Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2（P<0.01）；MCAO_D组倍数降低基因有Hmbox1、Klf7、Purb、Sesn3、15Xkr4，有显著差异的仅为Sesn3、Xkr4（P<0.01，P<0.05）。对P<0.01的5个基因Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2、Sesn3进行免疫组化研究。Cyp4b1、Sesn3、Ifi27免疫结果显示：Sham组弱阳性，阳性细胞数量少，阳性强度弱；MCAO组强阳性，阳性细胞数量多，强度强；MCAO_D组阳性强度减弱，其中Cyp4b1、Ifi27有显著性差异（P<0.05）。Rps4y2、Irf7免疫结果显示：Sham组强阳性，阳性细胞数量多，强度强；MCAO组弱阳性，阳性细胞数量20少，阳性强度弱；MCAO_D组阳性强度增强，且均有显著性差异（P<0.05）。结论：初步确定了与脑心通胶囊抗脑缺血作用相关的5个蛋白，且这些蛋白的作用主要集中到增强免疫应答、降低炎性反应、抗氧化应激和抑制细胞凋亡等方面。关键词：脑心通胶囊，脑缺血，基因芯片，Irf7，Ifi27中图分类号：R285.525StudyonGenesExpressionSpectrumofNXTintreatingFocalCerebralIschemiaRatModel11,211HUYan,LIUXin,WANGXuexi,LIXiaobin(1.InstituteofIntegratedChineseandWesternMedicine,SshoolofBasicMedicalSciences,30LanzhouUniversity;2.InstituteofChineseMateriaMedica,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences)Abstract:Objective:TodeteStudyonGenesExpressionSpectrumofNXTintreatingFocalCerebralIschemiaRatModelrminerelatedgenesandproteinsofNXTanti-cerebralischemia.Methods:Aftergenechipdetectionandrelateddataanalysis,geneswerepreliminaryscreenedoutandappliedQPCR35andcombinedwithimmunohistochemistry.RelatedgenesandproteinschangesituationofNXTinterventionfocalcerebralischemiaratmodelwereclear.Results:Throughdataanalysis,17geneswerescreenedoutandexcludedgenenottagging,responsevaluelow,atlast11geneswereverifiedwithQPCR.ComparedwithMCAO,thesegenesofCcnd2,Cyp4b1,Ifi27,Irf7,Qrich1,Rps4y2wereincreasedinMCAO_D,andthesegenesofCyp4b1,Ifi27,Irf7,Rps4y2hadsignificant40difference(P<0.01).ThesegenesofHmbox1,Klf7,Purb,Sesn3,Xkr4weredecreasedinMCAO_D,andthesegenesofCyp4b1,Sesn3,Xkr4hadsignificantdifference(P<0.01,P<0.05).Thesesignificantdifferenceoffivegenes,namelyCyp4b1,Ifi27,Irf7,Rps4y2,Sesn3werechosenandperformedimmunohiatochemicalstudy.Immunohiatochemicalresultsshow:inCyp4b1,Sesn3,Ifi27aspects,shamgroupshowedweaklypositive,lessnumberofpositivecellsandpositiveintensityweak.MCAO45groupshowedstronglypositive,morenumberofpositivecellsandpositiveintensitystrong.MCAO_Dgroupshowedpositiveintensitydecreased,andCyp4b1,Ifi27hadsignificantdifference(P<0.05).In基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金新教师类资助课题（20130211120021）作者简介：胡燕(1978-),女,高级实验师,主要研究方向:脑缺血疾病的现代研究及药物干预通信联系人：刘欣（1977-），男，副教授、硕导，主要研究方向：脑缺血疾病的现代研究及药物干预.E-mail:xinliu@lzu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnRps4y2,Irf7aspects,shamgroupshowedstronglypositive,morenumberofpositivecellsandpositiveintensitystrong.MCAOgroupshowedweaklypositive,lessnumberofpositivecellsandpositiveintensityweak.MCAO_Dgroupshowedpositiveintensityincreasedandhadsignificantdifference50(P<0.05).Conclusions:ThesefiveproteinsassociatedwithNXTanti-cerebralischemiaaredeterminedprimarilyandtheroleoftheseproteinsmainlyinenhancingtheimmuneresponse,reducinginflammation,anti-oxidativestressandinhibitingapoptosisaspects.Keywords:NXT;CerebralIschemia;Genechip;Irf7;Ifi2755当前医学生命科学已步入从生物分子网络的结构和功能来认识[1,2]生命活动的时代。在生命活动中，这些分子协调合作，当机体患[3]病或产生证候时，分子网络发生紊乱，甚至瓦解。中药或复方可作用于整个活性分子群的各种活性分子，对机体整个分子网络具有调节作用，可纠正分子网络失衡，如何发现主要作用分子，需借助于相关60的组学技术。基于此，本部分拟通过基因组学技术，结合QPCR及免疫组化验证，综合阐释脑心通胶囊改善缺血性脑卒中病变的分子机制。[4-7]研究表明，mRNA在脑缺血疾病过程中起着举足轻重的作用，相关靶mRNA可通过降解或抑制其翻译成蛋白从而调节下游基因在65信号通路中的作用，或通过靶mRNA的功能参与脑缺血病理生理过程。基于此，本研究拟利用高通量技术和生物信息学分析技术，从基因表达谱层面，筛选发现脑心通胶囊抗脑缺血病理损伤级联中起关键作用的分子。1材料与方法701.1实验材料与药品SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量200-220g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2012-0001；大鼠MCAO尼龙线栓[线身直径0.24mm，头端直径（0.36±0.02）mm，货号2632-100，北京沙东生物技术有限公司产品]；脑心通胶囊（规75格：0.4g/粒，陕西步长制药有限公司）；2XFastSYBRGreenPCRMasterMix（AppliedBiosystems,货号：4385612）；RNeasy®MiniKit（Qiagen，货号：74106）；逆转录试剂盒（Fermentas，货号：K1622）；大鼠全基因组表达谱芯片（台湾华联，大鼠ROA1.1芯片）；Cyp4b1抗体（ProteintechGroup，货号：11771-1-AP）；Sesn3抗体（OriGene，-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn80货号：TA309053）；Irf7抗体（Abcam，货号：AB62505）；Rps4y2抗体（Santa，货号：SC-85133）；Ifi27抗体（Abcam，货号：AB14695）；PCR引物由华联生物科技股份有限公司合成，参照GenBank中的Qrich1、Irf7、Ifi27、Rps4y2、Cyp4b1、Ccnd2、Sesn3、Purb、Klf7、Hmbox1、Xkr4、GAPDH的引物序列，Qrich1引物上游序列5"-GCA85CATGAAGCTGGCGTTCT-3"，下游序列5"-TTCACACTCTGGGGGCTTTC-3"；Irf7引物上游序列5"-ACCCACACAGGGTATGTCCC-3"，下游序列5"-AGAGTCCAGTAGGTGGCTGT-3"；Ifi27引物上游序列5"-ACATGGGAACAGAGGTGTCG-3"，下游序列5"-CCACGTAGGCAATCTGTGAT-3"；Rps4y2引物上游序90列5"-ATCCTGGCTCCTTTGACGTG-3"，下游序列5"-CTTGTTGCCCTTCCCGATCA-3"；Cyp4b1引物上游序列5"-CACAAGCCGTGACTCTTCCT-3"，下游序列5"-GTGTCCATGCTTTTGCCTCC-3"；Ccnd2引物上游序列5"-ACAACGGCTCCAAGTCTGTG-3"，下游序列5"-ACGAACACGCCTCTCTCTTG-3"；Sesn395引物上游序列5"-TGTGATACCGACACCATCCA-3"，下游序列5"-ATGTGGGAAAGCAGCCTCTG-3"；Purb引物上游序列5"-AGTGGATGAGGATTGAAGCGG-3"，下游序列5"-TGGGGACGAGTAGGAAAGGG-3"；Klf7引物上游序列5"-GGTTTCTCTCCTCCCGCATT-3"，下游序列5"-CCTTAATACCCACCCCGC100TC-3"；Hmbox1引物上游序列5"-CTCTGGGTGCTGTGTTACGA-3"，下游序列5"-CCAAAGGCGGAAGGCAGTAT-3"；Xkr4引物上游序列5"-TCCCATCCAAGGTCAAAGCG-3"，下游序列5"-AGTGGTAAGCCCTCAAGCAG-3"；GAPDH引物上游序列5"-CAACGGGAAACCCATCACCA-3",下游序列5"-ACGCCA105GTAGACTCCACGACAT-3"。1.2仪器安捷伦微阵列芯片扫描仪（型号：G2505，C安捷伦公司）；安捷伦2100生物分析仪（型号：G2940CA，安捷伦公司）；NanoDrop分光光度仪（型号：ND1000，赛默飞）；凝胶处理系统（型号：110AlphaImager2200，美国AlphaInnotech）；微型离心机（型号：5415R，-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnEppendorf）；PCR仪（型号：9700，美国AppliedBiosystems）；杂TM交炉（型号：HR-80，COCONO）；CFXConnect实时PCR仪（BIO-RAD）；TB-718生物组织包埋机；LeicaRM2235组织切片机；LeicaHI1220烤片机；LeicaST5020徕卡全自动组织脱水机；OlympusTM115bx51显微镜；AnymicroDSS图像采集系统。1.3动物分组与给药SD雄性大鼠于室温22-25℃，相对湿度50%-60%，12h明暗交替环境中适应3d后进入实验。随机分组，分为完全正常组（Naive），假手术组（Sham），模型组（MCAO），假手术给药组（Sham_D），模型120给药组（MCAO_D）。假手术给药组、模型给药组灌胃110mg/kg脑心通，其余各组灌胃等体积双蒸水，给药时间同第二章第一节“1.3”项下内容。1.4脑基因芯片样本制备及检测末次灌胃1h后造模，造模方法同第二章第一节“1.2”项下内容。125并于造模后12小时4%的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，将大鼠置于预冰后的解剖盘中，迅速打开胸腔，暴露心脏，分离主动脉弓，带线，用16号套管针从左心室插入，进入主动脉弓，结扎固定，拔出针心，剪破右心耳，灌注冰冷的0.9%氯化钠溶液，快速冲洗，直至血水变清，肝脏变白，迅速取出灌注冰冷的0.9%氯化钠溶液，快130速冲洗，直至血水变清，肝脏变白，迅速取出脑，分离出脑患侧的皮层，并将其装于冻存管中浸液氮后，-80℃保存，备用，待测。芯片检测由华联生物科技股份有限公司完成。1.5基因芯片质控及数据处理分析1.5.1RNA提取质检135完全正常组样本3个，其余每组样本6个。提取各组织RNA，电泳检测：1%琼脂糖凝胶，65V，17min；上样量：600ng样品+3.5ulLoadingBuffer；Marker：D200050ng/ul5ul，OD值检测，样本均合格。见图1。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn140图1脑皮层RNA质检图1.5.2Rosetta误差模型计算直方图显示所有探针（不包含质控探针和标记探针）倍数变化分布情况。通过RosettaResolver7.2计算信号的差异倍数，并通过AmershamPairwiseRationBuilder调整每个样本比较信号的误差。见145图2。图2脑皮层各组之间的直方图1.5.3芯片差异基因列表150火山图显示差异表达探针的分布情况，红色和绿色虚线代表切点。X轴代表倍数变化值，Y轴显示差异的显著性（以P值的负对数代表）。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn将所有探针的信号值（质控探针和标记探针除外）进行log2的对数转换，绘图。蓝点标记标准：|1.5倍|≧0.585且P-value<0.05。见图3。155图3脑皮层各组之间的火山图1.5.4主成分分析（principlecomponentanalysis，PCA）160PCA用于评估生物重复的差异及其处理情况。PCA采用正交变换，将一组观测到的可能相关变量转换成一组不相关变量的值被称为主成分。结果见图4。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4脑皮层基因芯片的主成分分析165注：左图，所有探针的PCA图；右图，差异基因PCA图。1.5.5聚类分析进一步数据分析，将生物重复进行汇集、计算，根据变化的倍数和P值识别差异表达基因。生物重复和处理条件之间的表达谱关系，通过无监督聚类分析显示。聚类分析直观的显示出重复和不同样本处170理条件的相关性。红色和绿色分表代表上调、下调。1.5.6脑心通抗脑缺血皮层差异基因的GSEAGeneOntology（GO）富集分析为了详细研究差异表达基因的功能分类，通过基因本体论（geneontology）对差异表达基因的分析，将差异表达基因按功能分为三大175类：生物过程（biologicalprocess，BP）、分子功能（molecularfuction，MF）和细胞组分（cellularcomponent，CC）。1.6Q-PCR检测根据RNeasy®MiniKit提取组织总RNA，用逆转录试剂盒拟转录成cDNA。每个样本检测重复3次，每反应包括20ngcDNA，500nM180上、下游序列和2XFastSYBRGreenPCRMasterMix，10ul的反应体积（具体见表1）。PCR扩增反应条件为95℃预变性20s，95℃变性5s，退火60℃30s，39个循环。用BIO-RADCFX处理软件3.0版进-ΔΔCt行数据分析，并以GAPDH为内参计算2值，其中检测了MCAO与MCAO_D组脑患侧皮层11个PCR变化情况，每组3个样本。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn185表110ul的反应体积FastSYBRnuclease-freRTproductF+Rprimertotalvolumemastermix(μl)ewater(μl)(20ng/μl)(10μM)(μl)5311101.7组织染色采用苏木素-伊红（HE）染色和免疫组化方法对Sham、MCAO、MCAO_D组进行检测，每组5只。大鼠造模后12h用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉成功后，用剪刀依次剪开皮肤、皮下组织及肋骨，190暴露出心脏，于左心室处剪一小口并留置穿刺针，随后在右心耳剪一小口，缓慢灌注4℃4%多聚甲醛，灌注结束后，取出脑组织，制作石蜡切片后，进行苏木素-伊红（HE）染色和免疫组化，具体方法如下：1.7.1苏木素-伊红（HE）染色195将石蜡切片放置在60℃的孵箱中烤12h；分别用松节油型透明剂（TO）I和II透明10min；100%乙醇浸泡5min；95%浸泡乙醇5min；90%浸泡乙醇5min；80%浸泡乙醇5min；流水冲洗拍干；使用苏木素染色10min；流水冲洗去苏木素染液约1min，拍干；用0.5%盐酸-乙醇分化约5s；流水冲洗约1min，拍干；使用氨水返蓝约2min；流200水冲洗约1min，拍干；使用伊红染色约10min；流水冲洗约1min，拍干；80%乙醇洗5min；90%乙醇洗5min；95%乙醇洗5min；100%乙醇（I）洗5min；100%乙醇（II）洗5min；松节油型透明剂（TO）（I）透明10min；松节油型透明剂（TO）（II）透明10min；中性树胶封片。2051.7.2免疫组化检测（1）将切片脱蜡至水：二甲苯Ⅰ15min；二甲苯Ⅱ15min；100%酒精Ⅰ10min；100%酒精Ⅱ5min；95%酒精5min；90%酒精5min；80%酒精5min；70%酒精5min；蒸馏水洗10min×2次；（2)抗原修复：枸缘酸缓冲液放入高压锅，水开后放入切片。盖好锅210盖，继续加热，喷气后计时2分钟，同时改用中火（140-160℃），2min后关火，马上放气，打开锅盖降温至室温；-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn（3）PBS洗3次，每次2min；（4）双氧水封闭：3%H2O2室温10min（注意避光），再用PBS洗3min×3次；215（5）滴加一抗（RPS4Y和IRF7抗体稀释度均为1：200，其余抗体稀释度均为1：100）：4ºC冰箱过夜；（6）取出切片，室温下放置30min，PBS溶液洗3min×3次；（7）滴加二抗：室温30min；（8）显色反应：先PBS溶液洗3min×2次，再室温DAB显色1-5min，220显微镜下观察，观察目标出现阳性后，蒸馏水洗终止反应；（9）自来水充分冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝；（10）脱水透明：70%酒精3min×1次；80%酒精3min×1次；90%酒精3min×1次；95%酒精3min×1次；100%酒精Ⅰ3min；100%酒精Ⅱ3min；二甲苯Ⅰ3min；二甲苯Ⅱ3min；225（11）中性树胶封片。1.7.3免疫组化采集图象及图像分析各抗体着色均表达于神经元细胞胞浆，高倍镜下拍摄3个视野，将采集的图像应用Image-proPlus5.1图像分析系统进行分析，所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积光密度（IOD），以IOD值作为230组织表达的定量标准。累积光密度（IOD）＝平均光密度（AOD）×阳性面积（A）。2结果2.1芯片2.1.1脑皮层差异基因变化235各组之间差异基因变化数见表3-2。差异基因选择标准：（1）log2|1.5|≥0.585且P<0.05；（2）log2=“NA”且两样本间的信号值≥1000。具体见表2。240-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表2脑的基因变化情况NOComparisonUp-regulatedDown-regulated1Sham_D/Sham48992Sham/Naive84153MCAO/Sham141014524MCAO_D/MCAO13222.1.2差异基因聚类分析获得所有样本差异基因并集（联集）共3065个探针，以ANOVA挑选在各组间差异最大的排名前250个差异基因进行层次聚类245（hierarchicalclustering，meancenter，averagelinkage）。5组可区分成两大类即I类：Naive、Sham和Sham_D，II类MCAO与MCAO_D，其中I类3组无明显分群，II类2组可明显分群，结果见图5。另将MCAO_DvsMCAO所获得的35个差异基因进行层次聚类，结果见图6。从图中可看到，聚类1、2、3所包含的17个基因（见250表3），在与Sham组比较，具有纠正作用的这些基因作为后期研究的重点。图5脑皮层基因数据的聚类分析注：N.完全正常组，S.假手术组，SD.假手术给药组，M.模型组，MD.255模型给药组，下图同。-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图6脑皮层模型组与模型给药组差异基因的聚类分析注：左图，脑皮层模型组与模型给药组差异基因的聚类分析；右图，15个基因的聚类分析。表317个差异基因芯片数据NormalizedIntensity_GroupIDGeneSymbolMCAOMCAO_DNaiveShamsham_DPH_rn_0001275Skint1052.0016.8837.8129.1336.33PH_rn_0012456LOC67914942.2125.0154.7934.2851.30PH_rn_0019726NA82.2641.6934.6934.2439.49PH_rn_0010209Qrich12041.664153.463172.293052.802773.47PH_rn_0018751NA25.01120.3123.1326.8425.83PH_rn_0000703Irf7366.79847.851094.281532.681496.18PH_rn_0002220Ifi274174.889299.229999.147351.409152.96PH_rn_0000878Rps4y2147.51301.78307.02217.18265.77PH_rn_0002724Cyp4b1104.24273.88474.03264.93417.87PH_rn_0001980Jmjd737.0542.2151.0047.7031.90PH_rn_0016220Asb1517.9533.2539.2531.3730.43PH_rn_0019974Ccnd21589.691080.061474.611288.431592.01PH_rn_0010763Sesn3864.41505.53949.63827.391329.23PH_rn_0022327Purb1811.961142.672075.281479.522468.30PH_rn_0022209Klf71073.43701.491013.50816.44777.07PH_rn_0020779Hmbox1392.87261.50394.57327.63399.36PH_rn_0021047Xkr41739.96720.692615.701845.692117.852602.1.3GO分析将上述15个差异基因进行GO分析，其分子功能（MF）包括核酸结合、蛋白结合、离子结合等，生物过程（BP）包括代谢过程、生物调整、应激反应、多细胞生物过程及发育过程等，细胞成分（CC）-11- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn包括核、大分子复合物、膜等。结果见图7。265图715个基因的GO分析2.2Q-PCR排除17个基因中未标注的2个及响应值低的4个基因（Skint10、LOC679149、Jmjd7、Asb15），对剩余11个基因进行Q-PCR验证，-ΔΔCt270并以GAPDH为内参计算2。结果显示，与MCAO比，MCAO_D倍数增加基因有Ccnd2、Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Qrich1、Rps4y2，有显著性差异的为Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2（P<0.01）；MCAO_D倍数降低基因有Hmbox1、Klf7、Purb、Sesn3、Xkr4，有显著差异的为Sesn3、Xkr4（P<0.01，P<0.05）。结果见表4，图8。275-12- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表4脑皮层MCAO与MCAO_D组对比11个基因相对表达量（x±s）基因倍数改变P值Ccnd21.09±0.110.2124180.000226Cyp4b11.75±0.150.111890Hmbox10.81±0.150.000304Ifi273.17±0.27Irf72.30±0.140.000019Klf70.89±0.160.3556480.394052Purb0.85±0.17Qrich11.13±0.210.706907Rps4y21.65±0.030.000001Sesn30.78±0.080.000594Xkr40.76±0.180.048499图8脑皮层模型给药组与模型组对比11个基因相对表达量2802.3组织染色2.3.1HE染色HE染色结果显示：Sham组：皮质神经细胞排列有序，形态如常，未见变性坏死等病变；间质神经毡如常；MCAO组：梗死区面积大，见多量液化性坏死区（软化灶），呈筛网状结构，神经变性、坏死，285以后者为主，坏死区内可见多量小胶质细胞增生，坏死边缘可见多量中性粒细胞浸润；MCAO_D组：梗死区面积减少，组织结构较有序，坏死神经较少，变性细胞较多，见极少量软化灶。结果见图9。-13- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnSham组MCAO组MCAO_D组290图9脑皮层各组HE染色(x200)2.3.2免疫组化选取Q-PCR数据中P值＜0.01的5个基因（Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2、Sesn3）作为免疫组化相关验证蛋白。结果显示：各组Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2、Sesn3阳性部位均在细胞浆。其中，Cyp4b1、295Sesn3、Ifi27免疫结果显示：Sham组弱阳性，阳性细胞数量少，阳性强度弱；MCAO组强阳性，阳性细胞数量多，强度强；MCAO_D组阳性强度减弱，其中只有Cyp4b1有显著性差异（P<0.05）。Rps4y2、Irf7免疫结果显示：Sham组强阳性，阳性细胞数量多，强度强；MCAO组弱阳性，阳性细胞数量少，阳性强度弱；MCAO_D组阳性强度增300强，且均有显著性差异（P<0.05）。结果见图10。Sham组MCAO组MCAO_D组图10-1脑皮层各组Cyp4b1免疫组化表达(x200)305Sham组MCAO组MCAO_D组图10-2脑皮层各组Sesn3免疫组化表达(x200)-14- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnSham组MCAO组MCAO_D组图10-3脑皮层各组Ifi27免疫组化表达(x200)310图10-4脑皮层各组Cyp4b1、Sesn3、Ifi27免疫组化表达变化情况(x200)Sham组MCAO组MCAO_D组图10-5脑皮层各组Rps4y2免疫组化表达(x200)315Sham组MCAO组MCAO_D组图10-6脑皮层各组Irf7免疫组化表达(x200)-15- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图10-7脑皮层各组Rps4y2、Irf7免疫组化表达变化情况注：与Sham组比较，***P＜0.001；与MCAO组比较，△P＜0.05，320△△P＜0.01。3讨论现代临床和实验研究证明，脑心通胶囊具有保护血管内皮功能[8,9][10][11]，稳定易损斑块，延缓动脉粥样硬化进程，降低血管阻力、[12][13]325扩张血管、增加血流速度、改善血液微循环，抗炎和抗血栓作用。那么具体到某一病或某一证方面，脑心通承载的作用特点又是什么呢？本研究通过HE染色显示，给予脑心通胶囊预防给药的脑缺血大鼠，脑梗死区面积减少，组织结构较有序，坏死神经元较少，变性细胞较多，见极少量软化灶。通过基因芯片实验结果显示，MCAO与330Sham相比差异基因变化明显（上调基因1410个，下调基因1452个），而MCAO_D与MCAO相比虽然差异基因变化相对较少（上调基因13个，下调基因22个），但从聚类和PCA分析看，还是能够很好的区分开来，且其中17个基因在MCAO_D组与MCAO组之间呈现负相关趋势。排除17个基因中未标注的和响应值低的，剩余共有11335个基因。对其进行Q-PCR验证分析，其中与MCAO比，MCAO_D倍数增加且有显著性差异的基因为Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2（P<0.01）；倍数降低且有显著差异的基因为Sesn3、Xkr4（P<0.01,P<0.05）。选取P＜0.01的5个基因进行免疫组化验证发现，给予脑心通胶囊预防给药的脑缺血大鼠脑组织中的Cyp4b1、Ifi27、Irf7、340Rps4y2蛋白均有明显的纠正作用，其中Irf7、Rps4y2蛋白变化趋势与基因变化趋势一致，而Cyp4b1、Ifi27蛋白变化与基因变化趋势并-16- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn不一致。Cyp4b1是细胞色素P450超家族成员之一，其蛋白定位在内质网[14]上。FrancescaSeta等通过实验发现，角膜Cyp4b1蛋白表达升高可345增高12-羟二十碳三烯酸(12-HETrE)——一个强有力的炎症和血管生成类二十烷酸，进而增加角膜的血管生成。Ifi27可以负向调控RNA聚合酶II启动子转录，调节核内蛋白的排除，I型干扰素信号通路，并[15][16]具有抗辛德毕斯病毒活性和减弱丙型肝炎的作用。除以上作用外，Ifi27还可迅速、稳定的释放线粒体中的细胞色素C，而细胞色素350C可通过Apaf-1因子多聚化caspases-9形成凋亡小体，导致下游Caspases的级联反应，激活Bax和Caspases2、3、6、8和9，促进细胞的凋亡。作为损伤激发的炎症和新生血管级联反应的组成部分Cyp4b1及具有促凋亡作用的Ifi27可能由于存在翻译调控，使得基因mRNA表达水平和蛋白表达水平不一致。正如大家所知，蛋白是机体355功能的执行者，本研究从蛋白表达水平看，脑缺血大鼠脑组织中Cyp4b1和Ifi27蛋白呈现高表达，MCAO_D组Cyp4b1、Ifi27蛋白表达水平显著下降，提示脑心通胶囊干预缺血性脑卒中机制中，抑制炎性反应、抗细胞凋亡可能是其重要机制之一。Irf7是干扰素调节因子（interferon，IFN）家族成员之一，是I型360干扰素依赖性免疫反应的关键转录调节因子，通过与干扰素刺激反应元件的结合来调节I型干扰素基因（α-干扰素、β-干扰素）和干扰素[17,18]刺激基因。其已被证实是诱导IFN表达的最主要调节因子，能够有效地激活MyD88非依赖性通路、MyD88依赖性通路以及Toll样受体活性，参与多种生物学过程，包括干扰素转录调控、病原体免疫反365应、细胞因子信号转导、细胞增殖调控和造血干细胞的发育、淋巴细胞的分化、自稳平衡过程，以及先天性免疫和适应性免疫调控等。[19]−/−+/+PhilbertaY.Leung等通过转基因小鼠（Irf7，Irf7）研究发现，Irf7是预处理TLR7激动剂Gardiquimod（GDQ）介导神经保护的关键调节环节，通过Irf7介导的IFN-α和激活typeIIFN受体可对缺血370大脑产生保护作用。本实验研究发现，脑缺血后大鼠脑组织中Irf7表达降低，而MCAO_D组变化较MCAO组变化相反，且有显著性，提示脑心通胶囊抗缺血性脑卒中的保护作用，可能也是通过激活Irf7-17- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn机制进而调节IFN-α实现的。Rps4y2是核糖体蛋白S4,Y染色体结合2，它定位在Y染色体上[20]375，分布在核糖体小亚基40S上，具有翻译作用，可促进蛋白合成。有研究发现，与其对应的核糖体大亚基60s相关蛋白RpS6磷酸化具[21]有很好的神经保护作用，以其同源的Rps4y可作为帕金森病的早期[22]的生物标识物，但未见Rps4y2蛋白的脑保护报道。而本实验研究发现，脑缺血模型大鼠脑组织中Rps4y2蛋白表达显著降低，药物干380预组蛋白表达显著升高，推测Rps4y2可能同样具有神经保护作用，脑心通可能通过增加Rps4y2表达，促进蛋白合成，发挥脑保护作用。Sesn3是Sestrin家族的成员之一，能够控制细胞内的活性氧，对[23–26]抗氧化应激，具有正向调节巨噬细胞、小胶质细胞和神经元作用。研究显示，其在未有炎症刺激下也能够调节如IL-1β、IL-1α、TNF-α[27]385促炎性基因的表达，并具有胰岛素反应、葡萄糖稳态和调节蛋白激酶B信号作用。本实验研究发现，脑缺血后大鼠脑组织中的Sesn3表达升高，其可能发挥两方面的作用，一是脑缺血状态下炎性反应的激活，二是机体对抗氧化应激的保护作用；而对于给药组，虽较模型组没有显著性差异，但有下降的趋势。390综上所述，通过以上研究，我们初步确定了与脑心通胶囊抗脑缺血作用相关的5个蛋白Cyp4b1、Ifi27、Irf7、Rps4y2、Sesn3，且这些蛋白的作用主要集中在增强免疫应答、降低炎性反应、抗氧化应激和抑制细胞凋亡方面，这恰好可对抗脑缺血的相关病理环节。我们推测预防性给予脑心通后，首先可激活机体的免疫应答反应，使机体处395于一种“戒备”状态，防止伤害的发生、发展；随之针对脑缺血的不同病理环节（炎性反应、氧化应激）起干预治疗作用。[参考文献](References)[1]梁茂新,刘进,洪治平,等著.中医证研究的困惑与对策[M].北京:人民卫生出版社,1998[2]李梢.中医证候生物分子网络标志的构想与研究[J].中医杂志,2009,50(9):773-776400[3]沈自尹.衰老-生理性肾虚证的HPAT轴分子网络调控研究[J].中国中西医结合杂志,2004,24(9):841-843[4]JeyaseelanK,LimKY,ArmugamA.MicroRNAExpressionintheBloodandBrainofRatsSubjectedtoTransientFocalIschemiabyMiddleCerebralArteryOcclusion[J].Stroke,2008,39:959-966[5]DharapA,BowenK,PlaceR,eatl.TransientfocalischemiainducesextensivetemporalchangesinratcerebralMicroRNAome[J].JCerebBloodFlowMetab,2009,29:675-687405[6]LimKY,ChuaJH,TanJR,eatl.MicroRNAsinCerebralIschemia[J].TranslStrokeRes,2010,1:287-303[7]LiuXS,ChoppM,ZhangRL,eaal.MicroRNAProfilinginSubventricularZoneafterStroke:MiR-124aRegulatesProliferationofNeuralProgenitorCellsthroughNotchSignalingPathway[J].PLOSONE,2011,6:e23461-18- 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