苯并芘（BaP）对栉孔扇贝生殖毒性效应的研究.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn苯并芘（BaP）对栉孔扇贝生殖毒性效应的#研究*潘鲁青，徐瑞邑，邓旭旭5（中国海洋大学水产学院，青岛，266003）摘要：本文研究了苯并芘（BaP）对栉孔扇贝（Chlamysfarreri）的生殖毒性效应，结果表明：BaP能显著干扰栉孔扇贝性腺中雌二醇（E2）和睾酮（T）的含量（P＜0.05），BaP胁迫导致卵巢中两种激素含量显著降低，且呈现剂量效应关系；BaP能显著抑制精巢中E2的含量，10但对T有诱导升高作用；与对照组相比，0.5和2.5μg/LBaP处理组中性腺指数（GSI）显著降低，而0.1μg/LBaP处理组无显著变化。不同浓度的BaP均对栉孔扇贝性腺造成了显著的DNA断裂损伤、蛋白质羰基化与脂质过氧化程度的升高，0.5、2.5μg/LBaP处理组对栉孔扇贝性腺DNA损伤影响显著（P<0.05），且损伤程度随染毒时间增加而增加；卵巢、精巢各处理组蛋白质羰基含量先升高后降低再升高，并于实验结束时显著高于对照组；性腺15中各组MDA含量逐渐升高，且2.5μg/LBaP处理组15d时MDA含量显著高于对照组。21d时观察对照组和2.5μg/LBaP处理组性腺组织的显微结构，发现对BaP能显著影响栉孔扇贝的性腺发育，包括对生殖细胞造成毒害作用和破坏滤泡壁的结构。由此表明，BaP对栉孔扇贝具有内分泌干扰效应和组织损伤效应，对其生殖造成了明显的毒害作用。20关键词：水产生物学；苯并芘；栉孔扇贝；内分泌干扰效应；性腺损伤；显微结构中图分类号：S917.4TheeffectsonreproductivetoxicityofscallopChlamysfarreri25exposedtobenzo[a]pyrenePANLuqing,XURuiyi,DENGXuxu(TheOceanUniversityofChina,FisheriesCollege,Qingdao,266003)Abstract:Thestudyinvestigatedthereproductivetoxicityeffectsofbenzopyrene(BaP)onscallopChlamysfarreri,andtheresultsshowedthatBaPcouldsignificantlyinterferethelevelsofsexhormone30includingestradiol(E2)andtestosterone(T)inthegonadofChlamysfarreri(P<0.05).Thetwohormonesdecreasedsignificantlyinovarian,anditshoweddose-effectrelationship,aswellasBaPcouldsignificantlyinhibitthecontentofE2intestiswhilethelevelsofTincreased.Comparingwiththecontrolgroup,thelevelsofGSIin0.5and2.5μg/LBaPtreatmentgroupsdecreasedsignificantly,whilethe0.1μg/LBaPtreatmentgrouphadnosignificantchange.DifferentconcentrationsofBaP35causedsignificantDNAdamage,proteincarbonylationandlipidoxidationdegreeincreasedingonads.The0.5,2.5μg/LofBaPexposedonChlamysScallopingonadshowedsignificantDNAdamage(P<0.05),andthedegreeofdamageincreasedaswellastheexposedtime.TheproteincarbonylcontentincreasedfirstandthendecreasedandincreasedfinallyinBaPtreatmentgroupoftestisandovary,whileattheendofexperimentthecontentsofBaPtreatmentgroupsweresignificantlyhigher40thanthecontrolgroup.MDAcontentofeachsexincreasedgradually,andthecontentsof2.5μg/LBaPgroupat15dweresignificantlyhigherthanthoseincontrolgroup.BaPcouldsignificantlyaffectthegonadaldevelopmentinChlamysScallop,includingantitheproliferationofgermcellsandmakethemdeformation.Inaddition,BaPcoulddamagethestructureofgonadaltissueinthefollicularwall.TheresultsshowedthatBaPhadcausedtheendocrinedisruptingeffectsanddamagetothetissuesof45ChlamysScallop,thusitcausedsignificanttoxicitytothereproduction.Keywords:aquaticbiology；BaP;Chlamysfarreri;endocrinedisruption;gonadaldamage;microstructure基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金《多环芳烃对栉孔扇贝生殖内分泌干扰分子机制的研究》（20130132110008）作者简介：潘鲁青（1966年），男，博导，主要研究方向：水产动物环境生理学.E-mail:panlq@ouc.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn500引言多环芳烃（Polynucleararomatichydrocarbons,PAHs）是一种持久性有机污染物（POPs），具有分布广、毒性高、持久存在难降解等特点，其中苯并(a)芘（Benzo[a]pyrene,BaP）是毒[1-2]性最强的PAHs，常被作为PAHs的代表种类加以研究。随着海上石油和轮船运输业的发[3]展以及工业、生活污水的大量排放，我国海洋环境中PAHs的污染日益加重，据李先国等[4]55报道青岛近海表层海水中PAHs的浓度范围为8.23ng/L~272.02ng/L；Hong等研究结果表明大连海域表层海水中PAHs的总含量为65ng/L~1130ng/L；我国近岸部分海域已接近中等污染水平。[5]目前关于PAHs对水生生物生殖毒性机制的研究已成为国内外热点问题。已有研究表明PAHs对脊椎动物具有很强的生殖毒性效应，而关于PAHs对无脊椎动物生殖毒性的研究[6]60甚少。栉孔扇贝（Chlamysfarreri）是我国北方浅海养殖的重要经济贝类，具有重要的经济价值，雌雄异体，营滤食生活，代谢率低，对海洋环境中的有机污染物等富集性较强，因此常被用作海洋环境污染监测的指示生物。本文研究了PAHs对栉孔扇贝性激素干扰效应和性腺损伤，旨在探究PAHs对栉孔扇贝生殖毒性机制，为我国贝类资源保护和PAHs污染监测提供技术支撑。651材料与方法1.1实验材料实验所用栉孔扇贝购自青岛南山水产品市场，壳高7.2±0.5cm。实验开始前采用青岛近海的自然海水暂养栉孔扇贝7～10d，海水盐度31，pH为8.2，温度为15±1℃，连续充气，3日换水100%，早晚各投喂定量（3g/m）螺旋藻粉。701.2实验方法1.2.1实验梯度设置经高效液相色谱法检测，本实验所用青岛近海自然海水中BaP含量约为4.13-66.69ng/L。实验梯度设置主要依据我国青岛近海海域中BaP、总PAHs的平均污染水平范围和BaP的溶[7-8]解度设定。BaP实验梯度设置为：0、0.1、0.5、2.5μg/L，并以自然海水作为对照组，实75验均设3个平行组。实验所用BaP为Sigma公司产品(St.Louis,MO,USA)，以二甲基亚砜为助溶剂，实验时保持二甲基亚砜浓度在各处理组中不变，且经预试验表明二甲基亚砜对栉孔扇贝生殖毒性各指标无明显影响。实验在50cm×40cm×30cm的塑料水槽内进行，每个水槽分别放栉孔扇贝40只，实验期间的养殖管理与暂养期间完全相同。于实验开始后0、3、10d、21d取样。取样时，从各80水槽内分别随机选取6只雌贝和雄贝，置于冰盘中解剖，取其性腺立即置于研钵中液氮研磨成粉末，准确称取0.1g组织置于离心管中（雌雄扇贝分开称取），-80℃保存待测。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.2性激素的抽提与测定[9]栉孔扇贝性腺中的性激素的提取参照Ketata等的方法：0.5ml纯水加入0.1g性腺组织中匀浆，并用超声波处理2次，每次为30s；向匀浆液中加入浓度为25mM的HCL400μL，8540℃下孵育15min后加入1.25ml浓度为0.07M的Na2HPO4；加入7ml二氯甲烷后1200g，离心10min分离有机相和水相并收集有机相（含激素），置于室温液氮干燥；加入250μL50g/L的牛血清蛋白将沉淀溶解，4℃保存待测。性腺组织中的性激素含量以pg/g(湿重)表示。1.2.3性腺指数（GSI）的测定称量对照组和实验组栉孔扇贝的软体部重量，然后分离性腺，将其用生理盐水冲洗后滤90纸吸去水分，称重之后使用下列公式计算：GSI=[性腺湿重(g)/软体部湿重(g)]*1001.2.4DNA碱解旋分析[10]参照Shugart的方法，进行碱解旋的测定。DNA提取：向性腺组织（80-100㎎）中加入0.45ml的裂解缓冲液和80μL10%的SDS，9555℃下水浴3小时，充分混匀；水浴后加入150μL饱和NaCl，13000rpm，15℃下离心20min，弃沉淀；加入等体积苯酚，缓慢混匀15min后静置5min；4℃13000rpm离心10min后将上层水相倒入小离心管，用PCI抽提两次；加入2倍体积无水乙醇和1/10体积3M醋酸钠（pH=5.2），20℃静置3小时，13000rpm离心15min，弃表面相；500μL70%乙醇洗涤2次，晾干后用TE缓冲液溶解；加入1μLRNAase去除RNA，37℃下反应30min。100碱解旋分析：将上述样品稀释至700μL，取100μL加入50μL0.05MNaOH，38℃孵育30min后加入50μL0.05MHCL和含0.2%SDS2mM的EDTA5μL，检测碱解旋DNA的荧光值X（auDNA）；取100μL样品80℃加热30min后冰上冷却，加入100μL250mmol/LNaCL和含0.2%SDS2mM的EDTA5μL，检测单链DNA的荧光值X（ssDNA）；取100μL样品直接加入100μL250mmol/LNaCL和含0.2%SDS2mM的EDTA5μL，检测双链DNA的荧105光值X（dsDNA）,F值计算公式如下：X(auDNA)—X(ssDNA)F=-----------------------------------------X(dsDNA)—X(ssDNA)1101.2.5蛋白质损伤测定[11]参照PatriziaMecocci方法，测定蛋白质羰基含量。制备性腺组织匀浆液：取80-100㎎性腺组织液氮研磨后加入15μl2,6-二叔丁基对甲酚和1.5mlTris-EDTA缓冲液作为抗氧化剂，1500g匀浆15min。测定羰基含量：将匀浆液5000g离心15min，分别吸取0.5mL上清液放入两管中，一管为115测定管，一管为空白管，然后向上清液中加入0.5mL1％TCA12000g离心15min，将蛋白质沉淀，测定管加入0.5ml2，4-二硝基苯肼，空白管加入0.5ml不含DNPH的2MHCl（避免HCl与反应液中一些物质反应生成对比色有影响的物质）。将样品在室温黑暗中反应1h，期间每15min斡旋一次。然后向样品中加入0.5mL的20%的TCA后在4℃，12000g离心15min，将沉淀用0.5mL乙醇－乙酸乙酯）混合物（1：1）清洗3次去掉自由的DNPH和-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn120脂质，最终的沉淀溶解在0.5mL6M盐酸胍中，在37℃置于带有混合器的水浴中1h。然后12000g离心15min。羰基含量在吸收光为370nm，摩尔吸光系数为22,000L•mol-1•cm-1[12]测定。羰基含量表示为nmDNPH/mgofprotein。蛋白含量测定使用考马斯亮蓝法。1.2.6脂质过氧化损伤测定[13]改自Wills的方法，测定次级氧化产物MDA含量。125制备性腺组织匀浆液：取80-100㎎性腺组织液氮研磨后加入磷酸缓冲液，0℃12000rpm离心3min；将匀浆液4℃3000rpm离心25min后取上清；将上清液4℃11000rpm离心45min后再次取上清液即获得组织液。测定MDA含量：在0.5μL组织液中加入0.25ml20%TCA和0.5ml0.67%硫代巴比妥酸试剂，90℃水浴孵育10min后3000rpm离心5min，取上清液；将200μL上清液在530nm处[12]130读取吸光度值OD530，单位为nmolMAD/mgprotein，蛋白含量测定使用考马斯亮蓝法。1.2.7显微结构观察3染毒后21d，分别解剖栉孔扇贝取卵巢和精巢切成1×1×0.5cm组织块，用Bouin’s液固定后采用一系列浓度的酒精脱水，系列二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度为4μm，脱蜡，复水后苏木精－曙红染液(H.E.)染色，尼康显微镜(Nikon,Japan)观察、拍照。1351.3数据处理与分析所有实验结果均以3个平行组的平均值±标准差（Means±S.D.）表示，利用SPSS17.0软件进行单因素方差分析（One-WayANOVA），取P＜0.05为差异显著。2实验结果2.1苯并芘对栉孔扇贝性激素含量和性腺指数的影响1402.1.1苯并芘对栉孔扇贝性激素含量的影响图1BaP对栉孔扇贝卵巢中雌二醇和睾酮含量的影响（湿重）Fig.1EffectsofBaPonE2andTinovaryofC.farreri.(wetweight)-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn145图2BaP对栉孔扇贝精巢中雌二醇和睾酮含量的影响（湿重）Fig.2EffectsofBaPonE2andTinspermaryofC.farreri(wetweight)图1显示，实验期间栉孔扇贝卵巢中雌二醇和睾酮都有峰值变化趋势，表明扇贝处于成熟期后期，不同浓度BaP胁迫均显著降低了两种激素的含量，且染毒浓度越高，性激素水平越低。由图2可知，实验期间雄性栉孔扇贝对照组雌二醇呈先升高后降低呈峰值变化，而150睾酮呈一直保持下降趋势。BaP胁迫显著影响了两种激素水平，三个处理组均显著抑制了雌二醇含量，但对睾酮有诱导升高作用，显示出一定的雄激素效应。2.1.2苯并芘对栉孔扇贝性腺指数的影响图3BaP对栉孔扇贝卵巢（A）和精巢（B）性腺指数的影响155Fig.3EffectsofBaPonovary(A)andspermary(B)GonadosomaticIndex(GSI)inC.farreri由图3可知，与对照相比，0.5和2.5μg/LBaP处理组中GSI显著降低，而0.1μg/LB[a]P处理组无显著变化。性腺指数变化趋势呈现剂量效应关系，其下降值随B[a]P浓度的增加而增大。2.2苯并芘对栉孔扇贝性腺的损伤效应160-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图4BaP对栉孔扇贝卵巢DNA单链断裂（A）、蛋白质羰基含量（B）、MDA含量（C）的影响Fig.4EffectsofBaPonDNAsinglestrandbreaks(A),proteincarbonylcontent(B)andMDAcontents(C)ofovaryinC.farreri165图5BaP对栉孔扇贝精巢DNA单链断裂（A）、蛋白质羰基含量（B）、MDA含量（C）的影响Fig.5EffectsofBaPonDNAsinglestrandbreaks(A),proteincarbonylcontent(B)andMDAcontents(C)ofspermaryinC.farreri.170由图4和图5可知BaP胁迫对栉孔扇贝卵巢和精巢DNA单链断裂、蛋白质羰基含量、MDA含量影响显著，对照组处于波动状态，无明显变化。在卵巢中，各染毒组F值在实验期间呈下降趋势，且0.5、2.5μg/LBaP染毒对栉孔扇贝卵巢DNA损伤（F值表示）影响显著（P<0.05），并随染毒时间增加，F值逐渐降低，DNA损伤程度加重。各处理组蛋白质羰基含量先升高后于6d降到最低点，之后反弹升高于10-15d时达到最高值，显著高于对照组，175之后降低但仍显著高于对照组水平。染毒期间，各组MDA含量有逐渐升高趋势，2.5μg/L-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnBaP染毒组15d时MDA含量显著高于对照组水平。在精巢中，0.1μg/LBaP染毒组在0-3天内F值有轻微上升趋势，随后逐渐降低，并于10d后显著低于对照组。0.5、2.5μg/LBaP染毒组实验期间，F值持续降低，显著低于对照组水平。各染毒组蛋白质羰基含量在0-3d内显著升高，并于3-6d时达到峰值，显著高于对180照组，随后在6-15d时逐渐下降，并于15-21d时再次反弹升高，21d时，0.1、2.5μg/LBaP染毒组蛋白质羰基含量显著高于对照组水平。各组MDA含量在染毒期间总体呈逐渐升高趋势，且0.5、2.5μg/LBaP染毒组MDA含量显著高于对照水平。2.3苯并芘对栉孔扇贝性腺显微结构的影响185图6BaP对栉孔扇贝卵巢显微结构的影响(21d)A对照组(×100)；B2.5µg/LBaP染毒21天(×100)N：细胞核；Nu：核仁；FC：滤泡细胞；Fw：滤泡壁；MO：成熟卵母细胞；→：滤泡间隙或胞间间隙；↑：模糊的滤泡壁Fig.6EffectsofBaPinfemalescallopC.farrerigonadsection(21d)190AControl(×100);Bexposedto2.5μg/LBaPfor21days(×100)N：nucleus；Nu：nucleolus；FC；folliclecell；Fw：follicularwall；MO：matureoocyte；Arrowsindicatetheinterspaceamongfollicles由图6可知，栉孔扇贝卵巢组织对照组滤泡排列紧密，少缝隙，内充满成熟卵细胞，卵细胞之间互相挤压，卵细胞的细胞质致密；2.5µg/LBaP处理组染毒21后，卵巢滤泡间出现195空隙并呈增大趋势，同时卵母细胞间排列也较疏松，卵母细胞变形且细胞质中也出现空隙。此外，滤泡壁细胞受损，排列散乱，界限变模糊。这些现象表明BaP能抑制栉孔扇贝卵巢的发育与成熟，并对滤泡壁细胞产生损伤作用。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图7BaP对栉孔扇贝精巢显微结构的影响（21d）200A对照组(×100)；B2.5µg/LBaP染毒21天(×100)Fw：滤泡壁；St：生殖小管；Sc：生殖小管腔；CT：结缔组织；→：滤泡间隙Fig.A7EffectsofBaPinmalescallopC.farrerigonadsection(21d)AControl(×100);Bexposedto2.5μg/LBaPfor21days(×100)Fw：follicularwall；St:seminiferoustubules;Sc:seminiferoustubulescavity;CT:connectivetissue205Arrowsindicatetheinterspaceamongfollicles由图7可知，栉孔扇贝精巢组织对照组滤泡内精子排列密集呈辐射状排列，发育正常；2.5µg/LBaP处理组染毒21后，精巢滤泡内出现空隙并呈增大趋势，精子数量减少，精子间缝隙变大，精子排列无规则，不再呈紧密的辐射状。此外，滤泡壁受损，滤泡间组织疏松，界限变模糊，表明染毒组的精巢发育受到了BaP抑制2103讨论3.1苯并芘对栉孔扇贝的内分泌干扰效应目前已研究证实软体动物中也存在类似于与脊椎动物的性激素类型以及合成代谢途径[14-15]，双壳贝类性激素E2和T会随生殖周期的改变而波动，间接证明了E2和T与贝类的[16]生殖功能有重大关系。本实验已检测出栉孔扇贝性腺雌二醇和睾酮的含量，同时BaP对215性腺雌二醇两种激素含量影响显著，中高浓度BaP胁迫（0.5µg/L和2.5µg/L）处理组性腺雌二醇含量降低，雌性贝类睾酮含量下降，雄性升高，性腺指数均明显减小，表现出明显的抗雌激素效应，这种精巢和卵巢组织中两种雌雄激素受BaP的影响不尽相同，这可能是由于多种机制共同作用的结果，如BaP可直接通过干扰类固醇合成酶的表达导致激素含量变[17]化。虽然BaP对雌雄栉孔扇贝性激素影响还不太明晰，但可以看出BaP能显著干扰雌、220雄栉孔扇贝性腺组织中雌二醇和睾酮含量，表现出了强烈的生殖内分泌干扰效应。3.2苯并芘对栉孔扇贝性腺的损伤效应本实验中BaP胁迫对栉孔扇贝卵巢、精巢DNA单链断裂有显著影响，卵巢、精巢染毒组F值在实验期间均呈下降趋势，且中高BaP浓度染毒组对F值影响显著，DNA损伤程度[18-19]加重，表明随时间延长对其损伤更严重且无法修复，这与Miao等和Tian等研究一致，[20]225也证实Gagné等贻贝（Elliptiocomplanata）性成熟期正在进行减数分裂的卵母细胞DNA合成/修复活性会受到BaP抑制的研究结论。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn本研究表明栉孔扇贝在BaP胁迫下卵巢、精巢蛋白质羰基含量均出现先升高后下降之后反弹的现象，表明在染毒过程中栉孔扇贝性腺蛋白质受到一定程度损伤后启动修复机制，受损害程度下降，随BaP胁迫时间延长，蛋白质损伤程度增加；同时卵巢、精巢各处理组230MDA含量随BaP暴露时间延长均有逐渐升高趋势，且呈现出时间剂量效应。这与Zheng等[21]研究发现向褐菖鱼（Sebastiscusmarmoratus）体内注PAHs，其肝脏的抗氧化防御系统受[22]到严重影响；杨涛等研究表明翡翠贻贝（Pernaviridis）在苯并荧蒽（BbF）染毒下消化盲囊MDA含量与BbF之间存在显著的时间-剂量效应，BbF可能通过氧化损伤途径产生毒性作用基本一致。[23]235外源物质对生物学大分子的破坏是致使生物组织受到损伤的重要原因。Archibong等[24]研究表明成年雄鼠吸入B[α]P其睾丸重量、生精小管长度和精细胞数各指标均显著降低，[25]说明吸入苯并芘会影响睾丸内分泌和精子发生；Aarab等曾发现海油和PAHs对贻贝外套[18]膜显微结构具有损伤作用，能使得雌性滤泡退化且滤泡周围存在大量血细胞；Tian等研究得出0.5和10μg/LBaP处理组雌性个体的卵巢结缔组织和卵母细胞受到了损伤。本研究240由2.5μg/LBaP染毒21d时栉孔扇贝性腺组织切片观察可知，高浓度的BaP使得卵巢滤泡间出现空隙并呈增大趋势，同时卵母细胞间排列也较疏松，卵母细胞变形且细胞质中出现空隙，随染毒时间延长卵母细胞变形严重且出现了退化现象，滤泡壁细胞受损；精巢滤泡内出现空隙并呈增大趋势，精子数量减少，时间延长后精子排列无规则，不再呈紧密的辐射状，滤泡壁受损，滤泡间组织疏松，界限变模糊，这说明BaP能抑制栉孔扇贝性腺的发育与成熟，245并对滤泡壁细胞产生了严重的损伤作用。这与上述研究结果类似，也证实上述性腺损伤指标的测定结果一致。4结论栉孔扇贝在BaP胁迫下性激素含量和性腺指数明显降低，对卵巢、精巢DNA、蛋白质、脂质具有明显的损伤效应，通过性腺组织显微观察Ba对性腺组织滤泡内生殖细胞数量增殖250延缓，且能毒害生殖细胞使其变形，排列无序，并使滤泡壁细胞间质疏松，滤泡壁界限模糊，表现出明显的一致性。由此BaP对栉孔扇贝具有明显的生殖内分泌干扰作用和组织损伤效应，说明BaP对栉孔扇贝造成了显著的生殖毒性效应。[参考文献](References)[1]刘汉霞,张庆华,江桂斌,等.多溴联苯醚及其环境问题[J].化学进展,2005,17(3):554-562.255[2]岳敏,谷学新,邹洪.多环芳烃的危害与防治[J].首都师范大学学报,2003,24:40-44.[3]李先国,邓伟,周晓,等.青岛近岸表层海水中PAHs的分布特征及物源初步解析[J].环境科学,2012,33(3):741-745.[4]HongWJ,JiaH,LiYF,etal.Polycyclicaromatichydrocarbons(PAHs)andalkylatedPAHsinthecoastalseawater,surfacesedimentandoysterfromDalian,NortheastChina[J].Ecotoxicologyandenvironmentalsafety,2602016,128:11-20.[5]WuQ,WangS,ChenX,etal.Reproductivetoxicityassessmentofbenzo[a]pyreneinthemarinepolychaetePerinereisnuntia[J].ChineseJournalofOceanologyandLimnology,2016:1-7.[6]DengX,PanL,CaiY,etal.TranscriptomicchangesintheovariesofscallopChlamysfarreriexposedtobenzo[a]pyrene[J].Genes&Genomics,2016,38(6):509-518.265[7]田蕴,郑天凌,王新红.厦门西港表层海水中多环芳烃(PAHs)的含量,组成及来源[J].2004.[8]丘耀文,周俊良,洪华生,等.大亚湾海域水体和沉积物中多环芳烃分布及其生态危害评价[J].热带海洋学报,2004,23(4):72-80.[9]BradfordMM.Arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[J].Analyticalbiochemistry,1976,72(1-2):248-254.270[10]KetataI,DenierX,Hamza-ChaffaiA,etal.Endocrine-relatedreproductiveeffectsinmolluscs[J].-9- 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