硫酸镁对放射性脑损伤中NF-κB和ICAM-1表达的影响.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn硫酸镁对放射性脑损伤中NF-κB和#ICAM-1表达的影响**徐瑞君，巫文威，关剑，崔凤梅，涂彧5（苏州大学放射医学与防护学院，苏州215100）摘要：目的：研究硫酸镁对放射性脑损伤时NF-κB（Nuclearfactor-kappaB），ICAM-1（Intracellularadhesionmolecular-1）表达变化的影响，探讨硫酸镁对放射性脑损伤防护作用的分子机制。方法：选择5Mev电子束对C57BL/6J小鼠全脑照射20Gy，建立脑损伤实验模10型。采集脑组织样本，采用HE染色方法检测小鼠脑组织的病理变化，实时定量PCR检测NF-κB和ICAM-1mRNA表达，免疫组织化学染色和酶联免疫吸附反应检测NF-κB和ICAM-1的蛋白表达。结果：与单纯照射组（Irradiation，IR）相比，实验用药组（Irradiation+MgSO4，IR+M）随着时间的延长，脑损伤的程度有明显的改善；与IR组相比，IR+M组NF-κB和ICAM-1mRNA和蛋白表达量明显降低，且差异具有统计学意义。结论：15硫酸镁能够降低放射性脑损伤中NF-κB和ICAM-1的表达，从而对放射性脑损伤起到防护作用。关键词：放射性脑损伤；NF-κB；ICAM-1中图分类号：R14620MgSO4effectsonexpressionofNF-κBandICAM-1inRBIXURuijun,WUWenwei,GUANJian,CUIFengmei,TUYu(SchoolofRadiationMedicineandProtection,SoochowUniversity215100)Abstract:Objective:Toinvestigatetheeffectofmagnesiumsulfateonthedynamicchangeofthe25NF-kappaBandICAM-1intheradiation-inducedbraininjury(RBI).ToresearchmolecularmechanismofprotectiveeffectofmagnesiumsulfateonRBI.Methods:C57BL/6Jmicewereadministeredbyelectronbeam(5MeV)toestablishtheratmodelofRBIwiththesinglefractionateddoseof20Gy.HEstainingmethodfordetectingpathologicalchangesofmicebrain.Quantitativereal-timePCRassaywereusedtodetectexpressionofNF-κBandICAM-1mRNA.30ImmunohistochemicalstainingandelisaassaymethodsfordetectingNF-κBandICAM-1proteinexpression.Results:AscomparedwiththeIRgroup,IR+Mgroupwiththeextensionoftime,thebraininjuryextenthavesignificantlyimproved.WhencomparedwithIRgroup,theexpressionofmRNAandproteinofNF-κBandICAM-1inIR+Mgroupweresignificantlydecreased.Conclusion:Magnesiumsulfatecanreduceradiation-inducedbraininjuryintheexpressionofNF-KappaBand35ICAM-1,soastoprotectthebrainradiationinjury.Keywords:Radiation-inducedbraininjury;NF-κB;ICAM-10引言放射治疗是头颈部恶性肿瘤治疗的一种有效的手段，但即使应用精确的立体定向技术也[1]会不可避免的引起肿瘤周围正常组织的放射损伤，尽管放射性脑损伤的发生率只有0.9%，40但一旦发生，预后往往很差。因此，对放射性脑损伤的研究引起了国内外的广泛关注，放射性脑损伤的保护剂成为了研究的重点。镁离子作为体内的一种必需元素，作为多种酶的辅助2＋因子，参与体内大多数的新陈代谢。早在1984年，Vacanti就提出Mg含量的下降是导致基金项目：国家自然基金（K112830513）作者简介：徐瑞君，女，硕士研究生，主要研究放射性脑损伤的防护通信联系人：涂彧，男，教授，博导，主要研究辐射防护.E-mail:tuyu@suda.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn中枢神经系统（CentralNervousSystem，CNS）继发性损伤的因素之一，损伤后及时补充2＋[2]2＋Mg可以减轻CNS的损害。同样的，学者通过实验证实，在CNS继发性损伤中Mg下[3,4][5]45降的幅度与组织损伤程度成正比。前期的实验研究表明，20Gy电子束全脑照射能引起大鼠脑组织中ICAM-1表达增加，早期给予硫酸镁能降低放射引起的ICAM-1的表达，从而使得脑损伤的程度减轻，对放射性脑损伤起到一定的保护作用。核转录因子NF-κB是一种广泛存在于真核生物细胞中，具有多向转录调节作用的核转录因子，在细胞增殖、生长分化、[6,7]凋亡、炎症反应、免疫应答等过程中发挥重要的调节作用。NF-κB能够被肿瘤坏死因子α50（TNFα）、白介素1（IL-1）、氧化应激、紫外光、细菌脂多糖（LPS）以及射线等激活，活化的NF-κB能够诱导IL-1、IL-6、IL-8、TNFα、ICAM-1等粘附分子、环氧化酶-2，诱导[8-10]型一氧化氮合酶（iNOS）等的表达。而正是这些炎症因子，使得瘤体周围正常组织受到损伤，以及放疗的剂量受到抑制。本研究通过检测小鼠脑组织中NF-κB和ICAM-1基因表达的情况，观察硫酸镁是否通过NF-κB/ICAM-1信号通路防护放射性脑损伤，从而为临床放55射性脑损伤的防护提供一定的实验依据。1材料和方法1.1主要试剂及动物硫酸镁注射液（国药集团容生制药有限公司），Ⅲ型抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒(GTVision公司)，NF-κB抗体和ICAM-1抗体(美国Abcam公司），TRIzol试剂（美国60Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒以及实时定量PCR试剂盒（日本TaKaRa公司），PCR引物由金维智科技有限公司合成。C57BL/6J小鼠购于上海斯莱克斯实验动物有限责任公司，鼠龄6-8周，雄性，体重20±2g。于苏州大学动物管理中心SPF（specificpathogenfree）级动物房饲养。1.2实验方法651.2.1动物模型制备及给药将C57BL/6J小鼠随机分为三组，空白对照组（Con组），单纯照射组（20Gy，IR组），实验组（20Gy加10%的硫酸镁注射液，IR+M组）。实验组在照射前3天连续腹腔注射10%硫酸镁注射液（300mg/kg）。将小鼠用1%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉，俯卧位，照射前于模拟机下定位，射野大小为20×2cm，照射野外用铅块遮挡。采用医用Siemens医用直70线加速器，用5MeV的电子束进行全脑前后对穿垂直照射，采用单次大剂量全脑照射，总吸收剂量为20Gy，吸收剂量率为300cGy/min，源皮距为100cm。1.2.2脑组织病理学观察在照射后1，7，14d，每组小鼠各取5只，将其颈椎脱臼处死后，用剪刀从颈部最细处剪断，将小鼠头部血迹清洗干净，并将头部周围的毛皮以及肌肉剪掉，露出头颅骨，用剪刀75尖端将头盖骨上的筋膜挑破，用血管钳小心的将头盖骨撬开，剪断两根视神经；用眼科镊小心的从前端将脑分离出来。将分离出来的脑组织立即放入福尔马林中，浸泡24小时以上。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn采用常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、摊片、脱蜡、水化等步骤得到组织病理切片进行HE染色，中性树胶封片，在光学显微镜下观察组织的病理学变化。1.2.3免疫组织化学染色检测NF-κB和ICAM-1表达80用上述石蜡包埋块进行切片。参考Ⅲ型抗鼠/抗兔通用型免疫组化检测试剂盒进行检测：脑组织经常规固定，脱水，透明，浸蜡，包埋，切片脱蜡，水化；高压修复（10mM柠檬酸盐缓冲液）；0.1%PBST洗3次，每次5min；滴加3%H2O2于组织上，避光孵育10min；0.1%PBST洗3次，每次5min；5%BSA室温封闭1h；一抗孵育，4℃过夜，或37℃,1h（抗-NF-κB抗体，1:500；或抗ICAM-1抗体，1:200）；0.1%PBST3次，每次10min，不85同的抗体分开洗；二抗：室温孵育30min；0.1%PBST3次，每次10min；DAB显色，光镜下控制显色。显色完全后，用蒸馏水冲洗终止显色；苏木素复染40s，自来水冲洗5min，温水(50-60℃)1min；蓝化；晾干后中性树胶封片。1.2.4实时荧光定量PCR检测NF-κB和ICAM-1mRNA表达每组小鼠分别于照后1,7,14d进行断头取脑，每组3只，检测NF-κB和ICAM-1mRNA90的表达情况。提取总RNA，测定RNA浓度，取少量提取的RNA进行逆转录合成cDNA，利用合成的cDNA进行实时定量PCR反应。QRT-PCR反应中所用引物如表1所示：表1.实时荧光定量PCR的引物序列Table1:QRT-PCRprimersequencemRNA碱基序列NF-κBmRNA（上游引物）GACCACTGCTCAGGTCCACT（下游引物）TCATCTATGTGCTGCCTCGTICAM-1mRNA(上游引物)CGAAGCTTCTTTTGCTCTGC（下游引物）GTCCAGCCGAGGACCATAACTBmRNA(上游引物)GGATGCAGAAGGAGATTACTGC（下游引物）CCACCGATCCACACAGAGTA1.2.5Elisa方法测定NF-κB和ICAM-1蛋白的含量95每组小鼠分别于照后1,7,14d进行断头取脑，每组3只，进行Elisa实验。简单步骤如下：（1）脑组织匀浆液的制备：取适量的脑组织，用预冷的PBS冲洗干净，并用剪刀尽可能将组织剪碎；在液氮冷冻的条件下，用研钵将样品磨成粉状，加入1ml预冷的1×PBS，冰上继续研磨直至呈现液体状；离心取上清；BCA法测定样品中蛋白浓度；用预冷的1×PBS将样品稀释至适当的浓度，分装后进行实验或者-80℃保存。（2）标准品以及样品的测定，100按照Elisa检测试剂盒的使用说明进行操作。1.2.6统计学分析所有实验数据用x±s表示，采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理。两组间比较采用独立样本t检验，多个样本间的均数比较采用方差分析，P<0.05时认为有统计学意义。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1052结果2.1脑组织病理学的变化各实验组小鼠脑组织病理变化见图1，从A图中可以看出，空白对照组细胞形态呈现多极化，且没有脑水肿的改变，脑组织结构以及层次清楚。在照射后1d（IR1d）细胞开始肿胀，细胞形态多样化，并伴随着毛细血管间隙增宽。在照射后7d，脑水肿的状况进一步110加剧，血栓形成。在照后14d，海绵状结构改变，炎性细胞浸润。B图与A图的IR组相比，脑组织损伤的情况有所减轻，细胞的多级性开始呈现，脑水肿的现象也有所缓解。而且在用药后第14d细胞的多级形态开始出现，与Con组相比只有轻微的细胞肿胀。说明硫酸镁能够改善放射性脑损伤组织的病理变化。115AB120注：A.照射后1、7、14天后小鼠脑组织的病理变化。B.用药后1、7、14天小鼠脑组织的病理变化。125图1.硫酸镁干预后对小鼠脑组织病理变化的影响Figure1:EffectsofMgSO4onpathologicalchangesofbraintissueinmice2.2NF-κB、ICAM-1mRNA表达QRT-PCR的方法检测各实验组小鼠脑组织中NF-κB、ICAM-1mRNA的表达，如图2、图3所示：各实验组在照射后7d、14dNF-κBmRNA表达升高；在照后第7天表达量最多；130与IR组相比，IR+M组mRNA的表达有明显的降低，且差异具有统计学意义（P<0.05）。同样的，ICAM-1mRNA的表达变化表现出与NF-κB相同的趋势（图3）这一结果说明，硫酸镁能够降低照射后小鼠脑组织中NF-κB、ICAM-1mRNA的表达。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn注：与Control组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05。135图2.硫酸镁对照射后小鼠脑组织中NF-κBmRNA表达的影响Figure2:EffectsofMgSO4onexpressionofNF-κBmRNAinbraintissueafterirradiation注：与Control组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05。图3.硫酸镁对照射后小鼠脑组织中ICAM-1mRNA表达的影响140Figure3:EffectsofMgSO4onexpressionofICAM-1mRNAinbraintissueafterirradiation2.3NF-κB、ICAM-1蛋白表达采用Elisa试剂盒和免疫组化两种方法检测NF-κB和ICAM-1的蛋白表达水平，结果见图4。结果可知：与对照组相比，照后一天，NF-κB蛋白的表达量明显上升，到第7d蛋白表达量达到最大，与第7d相比第14d蛋白的表达量有下降趋势。与IR组相比，IR+M145组蛋白表达量都有所下降，且都具有统计学意义。ICAM-1蛋白的表达变化与NF-κB蛋白表达变化具有一致性，如图4（右）所示。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn*#注：:与Con组相比，P<0.05，:与IR组相比，P<0.05。图4Elisa检测硫酸镁干预后对NF-κB/ICAM-1蛋白表达影响150Figure4:EffectsofMgSO4onexpressionofNF-κB/ICAM-1proteininbraintissueafterirradiation免疫组化检测NF-κB蛋白表达的结果如图5所示：从图中可以看出：照射后1d，NF-κB蛋白表达量即开始大量增加，在第7d蛋白的表达量达到最高。IR+M组在照后1d，蛋白的表达量较IR组有所下降（P<0.05），在第7，14d蛋白表达量明显下降（P<0.05）。表明硫酸镁能够降低NF-κB蛋白的表达。155注：与Control组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05。图5.硫酸镁干预后NF-κB蛋白表达变化Figure5:ChangesofNF-κBproteinexpressionafterMgSO4intervention免疫组化检测ICAM-1蛋白表达的结果如图6所示：从图中可以看出，照射后1d，160ICAM-1蛋白表达量即开始大量增加，在第7d蛋白的表达量达到最高。IR+M组在照后1天，蛋白的表达量较IR组同样有所下降（P<0.05），且在第7，14d蛋白表达量明显下降（P<0.05）。表明硫酸镁能够降低ICAM-1蛋白的表达。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn165170注：与Control组相比，*P<0.05；与IR组相比，#P<0.05。图6.硫酸镁干预后ICAM-1蛋白表达变化175Figure6:ChangesofICAM-1proteinexpressionafterMgSO4intervention3讨论放射治疗是头颈部肿瘤治疗常用的方法，但即使再精确的定位，也会照射到肿瘤周围正常的组织，从而对放射的剂量产生影响，而且严重影响了患者的生活质量。因此，对放射性脑损伤的防护作用逐渐成为研究的热点。镁离子是近20年来神经保护剂研究的热点，而且张[11]180炜等的实验结果发现早期给予MgSO4,能显著降低放射性脑损伤大鼠的ICAM-1含量以及MPO的活性从而减轻放射性脑损伤大鼠脑组织的炎性效应，发挥细胞保护作用。Divya[12]Kesanakurti等实验表明放射性脑损伤能够激活NF-κB，而活化的NF-κB能够诱导多种炎症因子如ICAM-1的表达，从而加剧脑损伤的程度。而ICAM-1的启动子中包含通用元素[13,14]SP-1,AP-1，NFATc1以及NF-κB转录的起始位点，因此ICAM-1基因的表达受到NF-κB[15]185的调控。徐华林的体外实验表明：硫酸镁可能通过抑制NF-κBmRNA的表达，阻止NF-κB[5]的核转位来降低ICAM-1mRNA和蛋白水平的表达，减轻炎症反应。张朦的体内实验结果也显示：硫酸镁可以减少辐射诱导的NF-κBmRNA和蛋白表达。这也就为研究镁离子对放射性脑损伤保护作用的分子机制提供了基础。本研究发现，正常小鼠脑组织在受到20Gy电子束照射后第1天NF-κBmRNA的表达开190始上升，在照射后7d表达量最多。免疫组化的结果表明NF-κB蛋白的表达量在照射后7d达到最高。与此同时，ICAM-1mRNA及其蛋白的表达表现出与NF-κB相同的变化趋势。这说明，硫酸镁对放射性脑损伤防护作用的分子机制可能是通过降低NF-κB基因的表达，从而使得其下游炎症因子ICAM-1的表达受限，即NF-κB/ICAM-1这一信号通路进行的。由此可见，辐射能够诱导NF-κB的活化，而活化的NF-κB使得其下游的炎症因子ICAM-1表达量增加，从195而使得放射性脑损伤的程度进一步加剧。而镁离子能够降低NF-κB和ICAM-1基因的表达，从而对放射性脑损伤起到一定的防护作用。这也为镁离子应用于临床试验提供了一个理论依据。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[参考文献](References)200[1]梁霁，郑金瓯．放射性脑病48例的影象学特征[J].广西医学，2007，29(12)，1927-1929.[2]VacantiFX,AmesA3rd.MildhypothermiaandMg2+protectagainstirreversibledamageduringCNSischemia[J].Stroke.1984.15(4):695-698.[3]VinkR,McIntoshTK,DemediukP,etal.DeclineinintracellularfreeMg2+isassociatedwithirreversibletissueinjuryafterbraintrauma[J].JBiolChem.1988.263(2):757-761.205[4]BareyreFM,SaatmanKE,HelfaerMA,etal.Alterationsinionizedandtotalbloodmagnesiumafterexperimentaltraumaticbraininjury:relationshiptoneurobehavioraloutcomeandneuroprotectiveefficacyofmagnesiumchloride[J].JNeurochem.1999.73(1):271-280.[5]张朦，熊耀祖，涂彧，等.大鼠放射性脑损伤模型中核转录因子一κB表达的动态变化规律.[J].中华放射医学与防护杂志，2015，35（9）：657-662.210[6]BaldwinAS.，Jr.Seriesintroduction:thetranscriptionfactorNF-kappaBandhumandisease.JClinInvest.2001,107:3-6.[7]LernbecherT，MullerUWirthT.DistinctNF-kappaB/Reltranscriptionfactorsareresponsiblefortissue-specificandinduciblegeneactivation.Nature.1993,365:767-770.[8]ShimizuN，AzumaN，NishikawaT，etal.Effectonveingraftintimalhyperplasiaofnuclearfactor-κBdecoy215transfectionusingthesecondgenerationofHVJvector[J].JCardiovascSurg(Torino)，2007，48（4）：463-470.[9]ShimizuS，TaharaM，OgataS，etal.Involmentofnuclearfactor-kBactivationthroughRhoA/Rho-kinasepathwayinLPS-induced-IL-8productioninhumancervicalstromalcells[J].MolHumReprod，2007,13（3）：181-187.[10]ODonneBSM，HolmGH，PierceJM，etal.IdentificationofanNF-kappaBdependentgenenetworkin220ce1lsinfectedbymammalianreovirus[J].JVirol，2006,80（3）：1077-1086.[11]张玮，涂彧，王利利，等．MgSO4对放射性脑损伤大鼠脑组织早期炎症反应的影响[J].辐射研究与辐射工艺学报，2009，7（4）：234-238．[12]DivyaKesanakurti1,ChandramuChetty1,DilipRajasekharMaddirela1,MeenaGujrati2,andJastiS.Rao.EssentialRoleofCooperativeNF-κBandStat3RecruitmenttoICAM-1IntronicConsensusElementsinthe225RegulationofRadiation-inducedInvasionandMigrationinGlioma.[J].Oncogene.2013.32(43):546-569.[13]VorabergerG,SchaferR,StratowaC.Cloningofthehumangeneforintercellularadhesionmolecule1andanalysisofits5′-regulatoryregion.Inductionbycytokinesandphorbolester.JImmunol.1991;147:2777-2786.[14]LedeburHC,ParksTP.Transcriptionalregulationoftheintercellularadhesionmolecule-1genebyinflammatorycytokinesinhumanendothelialcells.EssentialrolesofavariantNF-kappaBsiteandp65230homodimers.JBiolChem.1995;270:933-943.[15]徐华林，孙阳，崔凤梅，涂彧．硫酸镁抑制辐射后人脐静脉血管内皮细胞γ-H2AX的表达[J]，中华放射医学与防护杂志，2015，35(3)：161-164．-8-'