生长抑制特异蛋白GAS2促进BCR-ABL恶性转化BaF3细胞.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn生长抑制特异蛋白GAS2促进BCR-ABL恶性#转化BaF3细胞11211**瞿伟伟，薛文，刘红，赵昀，张秀艳5（1.苏州大学唐仲英血液学研究中心，苏州215123；2.苏州大学附属第一医院，苏州215006）摘要：目的：生长抑制特异蛋白GAS2在CML患者细胞中表达增高，高表达的GAS2能产生怎样的生物学效应尚不明确。本工作以小鼠前B细胞BaF3为模型，研究GAS2对BaF310和BaF3/BCR-ABL细胞体内外生长中的影响，并检测GAS2对细胞中Stat5a表达的影响。方法：利用慢病毒递送GAS2到BaF3和BaF3/BCR-ABL细胞中并使用流式细胞术分选被病毒侵染的细胞。检测GAS2过表达对BaF3和BaF3/BCR-ABL细胞的钙蛋白酶活性、细胞增殖和集落生成的影响；并将这些细胞注射入小鼠以研究GAS2对它们致白血病能力的影响。通过qRT-PCR和westernblot分析过表达GAS2对Stat5表达的影响。使用qRT-PCR检测15GAS2在慢性髓细胞白血病（CML）慢性期和急变期患者CD34+细胞中的表达。结果：过表达GAS2能活化细胞的钙蛋白酶活性，但不影响BaF3和BaF3/BCR-ABL细胞的体外增殖和集落生成能力。GAS2未诱发小鼠白血病，但GAS2显著加快BCR-ABL诱发的小鼠白血病。GAS2不影响细胞中Stat5a的mRNA表达，但增加其蛋白表达。我国CML患者中GAS2的表达随疾病进展而显著增高。结论：GAS2具有促进BCR-ABL恶性转化BaF3细胞恶性20转化的能力，且伴随有Stat5a蛋白的积累；部分揭示了GAS2高表达CML发生发展中的生物学意义。关键词：白血病；GAS2；Stat5；细胞生长；小鼠白血病模型中图分类号：R733.725Growth-arrestspecific2promotesBCR-ABLmediatedleukemogenesis11211QuWeiwei,XueWen,LiuHong,ZhaoYun,ZhangXiuyan(1.CyrusTangHematologyCenter,SoochowUniversity,Suzhou215123;2.TheFirstAffiliatedHospital,SoochowUniversity,Suzhou215006)30Abstract:Objective:Growth-arrestspecific2(GAS2)isaberrantlyexpressedinhumanchronicmyeloidleukemia(CML),howevertheeffectsofelevatedGAS2expressionisnotclearyet.ThisstudyaimedtoelucidatetheeffectsofGAS2overexpressiononthepropertiesofbothBaF3andBaF3/BCR-ABLcells.Methods:GAS2wasdeliveredwithlentiviralvectorintoBaF3andBaF3/BCR-ABLcells,thenthetransducedcellswerepurifiedwithFACS.Thecalpainactivity,cellular35proliferationandcolony-formingcell(CFC)productionofthesecellswereassessed.Thesecellswerealsoinjectedintomicetostudytheirabilitiestoinduceleukemia.BothqRT-PCRandwesternblotwereusedtodetecttheexpressionofStat5auponGAS2overexpression.ThetranscriptexpressionofGAS2wascomparedbetweenCMLpatientsinchronicphase(CP)andthoseinblastcrisis(BC).Results:GAS2wasabletoactivatecalpain,howeverthegrowthandCFCproductionofbothBaF3and40BaF3/BCR-ABLcellswerenotaffected.GAS2alonedidn’tinducelekukemia,howeverGAS2acceleratedBCR-ABLinducedleukemia.GAS2elevatedStat5aexpressionposttranscriptionally.ThetranscriptexpressionofGAS2waselevatedinCMLpatientsinBCthanthoseinCPusingasmallcohortofpatientsrecruitedfromTheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity.Conclusion:GAS2iscapabletopromoteBCR-ABLmediatedmalignanttransformationofBaF3cellsand45associatedwithelevatedStat5aprotein,whichhighlightsthecriticalroleofGAS2intheinitiationandprogressionofCML.Keywords:Leukemia;GAS2;Stat5;Proliferation;miceleukemiamodel基金项目：国家自然科学基金面上项目（31371392）作者简介：瞿伟伟（1990-），女，硕士研究生，白血病干细胞通信联系人：张秀艳（1984-），女，助理研究员，白血病干细胞.E-mail:capricorn_nh@foxmail.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn500引言慢性髓细胞白血病（chronicmyeloidleukemia，CML）是起始于造血干细胞（hematopoietic[1,2]stemcell，HSC）的恶性血液肿瘤。融合基因BCR-ABL编码的酪氨酸激酶产物异常活化，是诱发该疾病的重要因素。临床上分为慢性期（chronicphase，CP）、加速期（acceleratedphase，[3]AP）和急变期（blastcrisis，BC）。特异靶向BCR-ABL酪氨酸激酶的抑制剂（tyrosinekinase55inhibitor，TKI），如甲璜酸伊马替尼（imatinibmesylate，IM）可有效缓解慢性期CML患[4,5][6]者的症状。然而，单独使用IM不能治愈CML，患者始终存在药物耐受和复发的风险。已有研究表明，TKI能进入CML干/祖细胞且有效抑制BCR-ABL活性，但无法有效诱发这[7,8]些细胞的凋亡；提示存在不依赖BCR-ABL的信号途径调控这些细胞的生存与生长。最近，英国科学家联合使用两种化合物进行临床前研究，分别激活p53和抑制c-Myc，能有效[9]60抑制CML干/祖细胞的体内外生长。因此，对CML干/祖细胞生长的分子机制进行深入研究，不仅可以深化对CML致病分子机制的认知；也有望改善该疾病的治疗。GAS2（growtharrest-specific2）属于生长抑制特异性基因GAS家族，主要定位于细胞[10]内肌动蛋白细胞骨架，分布于应力纤维和细胞膜边缘。GAS2在肿瘤细胞增殖中具有双重[11]作用。一方面GAS2通过其C-端与微管蛋白结合而抑制细胞的分裂。GAS2可通过抑制[12]65Calpain2稳定p53而使细胞对依托泊苷诱发的细胞凋亡更加敏感；诱发细胞衰老而抵抗恶[13]性转化；过表达的GAS2能增强依托泊苷诱发MCF7细胞（表达野生型p53）凋亡的能力[14]。这些显示GAS2可能抑制肿瘤细胞增殖或增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，具有抑癌基因的功能。另一方面，GAS2/calpain2轴可调控细胞内β-catenin或Stat5的积累，而后[15,16]两者具有促肿瘤细胞生长的功能。有研究显示GAS2在多种恶性血液病中异常高表达，70包括骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferativeneoplasmas,MPNs）、CML、急性髓细胞白血病（acute[17-19]myeloidleukemia,AML）和急性淋巴细胞白血病（acutelymphoidleukemia,ALL）等。荷兰和美国学者的研究显示CML由慢性期到急变期的转化过程中，GAS2的表达随着疾病[20,21]的进程升高，但针对我国患者的研究尚未展开。包括本课题组的研究显示GAS2沉默能[18,19,22]减缓白血病细胞的体内外生长；然而，GAS2高表达能否促进白血病细胞生长的研究75还未见报道。BaF3细胞是依赖小鼠白介素-3（mIL-3）生长的非转化血液细胞株，常常被用于研究血液恶性肿瘤相关基因的恶性转化能力。本研究中，我们使用慢病毒载体递送GAS2进入BaF3细胞或BaF3/BCR-ABL细胞，而后分析GAS2单独或与BCR-ABL共同表达对细胞体外生-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn长及诱发白血病能力的影响。我们也分析GAS2对BaF3和BaF3/BCR-ABL细胞中Stat5a+80表达的影响，还检测正常供体、CML慢性期和急变期患者CD34细胞中GAS2的表达。研究结果显示GAS2未能恶性转化BaF3细胞，但它能增强BCR-ABL诱发小鼠白血病的能力；且使细胞中的Stat5积累。在我国CML患者中GAS2的表达随CML疾病进展而显著增高，提示GAS2在CML发生和发展过程中具有重要功能。1材料与方法851.1材料1.1.1菌株、质粒和细胞TOP10菌株及慢病毒包装辅助质粒（Rev，ΔR和VSV-G）由本实验室保存；过表达GAS2的慢病毒载体Venus由本实验室保存。BaF3细胞由加拿大卑诗大学（UniversityofBritishColumbia）的XiaoyanJiang教授惠赠。293T细胞购自中国科学院上海细胞库。901.1.2主要试剂和仪器胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；GAS2单克隆抗体（ab55076）购自Abcam公司；Stat5多克隆抗体（#9693）购自CST（CellSignalingTechnology）公司；Tubulin抗体（ab009-100）购自联科生物公司；辣根过氧化物酶标记的二抗购自碧云天公司；甲基纤维素购自STEMCELLTechnologies公司。荧光定量PCR仪（ABI7500）购自美国AppliedBiosystems95公司；流式细胞分选仪（FACSAriaIII）购自美国BectonDickinson（BD）公司。1.2方法1.2.1细胞培养293T细胞使用DMEM完全培养基（含10%FBS）培养；BaF3细胞由RPMI1640完全100培养基（含10%FBS），并添加mIL-3（5ng/mL）培养。BaF3/BCR-ABL细胞不需添加mIL-3。这些细胞都在恒温培养箱内37℃培养（5%CO2）。1.2.2病毒制备[18]参照本实验室已发表的工作进行病毒制备，方法简述如下：将293T细胞培养在10cm细胞培养皿中，使用磷酸钙沉淀法将辅助质粒（Rev，ΔR和VSV-G）分别与对照质粒Venus105和过表达GAS2的Venus-GAS2转染293T细胞。12h后更换新鲜培养基，并在48h和72h后收集含有病毒颗粒的培养上清（viruscontainingmedia，VCM），0.45μm滤器过滤、分装后置-80℃冰箱保存，待用。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.2.3qRT-PCR使用RNAprepPure微量样品总RNA提取试剂盒提取RNA（TIANGEN）；采用110PrimerScriptRTreagentkit试剂盒（ThermoFisher）逆转录合成cDNA第一链，然后进行-ΔΔqRT-PCR检测。以β-ACTIN为内参，采用2CT法计算目的基因的相对表达。基因特异引物信息总结在表1.中。115表1.qRT-PCR检测使用的引物序列Table1.Thegene-specificprimersusedinthisstudyGenesymbolsPrimersequences(5’-3’)Ampliconsize(bp）ACTINFCACCATTGGCAATGAGCGGTTCC90(humosapiens)RGTAGTTTCGTGGATGCCACAGGGAS2FGCAACCCAGAGAAGTGTGTCT74(humosapiens)RCAGGAGGCTCCACACCATActinFGAGACCTTCAACACCCCAGC262(Musmusculus)RATGTCACGCACGATTTCCCStat5aFCCTGTTTGAGTCTCAGTTCAGCG116(Musmusculus)RTGGCAGTAGCATTGTGGTCCTG1.2.4细胞增殖实验4120在24孔板中接种细胞（2×10细胞/孔），在培养第3天和第6天进行计数并绘制生长曲线。1.2.5集落生成实验（CFC）1.5mL甲基纤维素中添加双抗、IMDM培养基并种植450个细胞，终体积为1.65mL，混匀后注射器吸取1.1mL（即300细胞）接种至35mm培养皿中，37℃培养10天后计数。125BaF3细胞进行CFC时甲基纤维素中需要添加mIL-3（5ng/mL）。1.2.6Westernblot细胞用蛋白裂解液裂解后采用BCA法蛋白定量，SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，然后加入GAS2抗体（1:2000）、Stat5抗体（1:2000）、或Tubulin抗体（1:8000），4℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1~2h，1×TBST130洗膜后，ECL显影并曝光。1.2.7小鼠白血病模型46~8周BalB/C小鼠经6cGy钴源照射后，各类BaF3细胞（2.5×10/小鼠）与未经照射5的小鼠骨髓细胞（7.5×10/小鼠）经尾静脉注射入小鼠体内，每组有实验动物8只。实验小-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn鼠在SPF级动物房内饲养，隔天观察各组小鼠状态，称取小鼠体重。待小鼠出现毛色发黄，135四肢无力及弓背等病征时将小鼠取出，处死小鼠，提取骨髓，解剖剥取肝脏和脾脏，观察并称重。该实验通过苏州大学伦理委员会审批。1.2.8统计学分析所有实验均进行3次以上生物学重复，数据采用GraphpadPrism5.0处理，结果以平均值±标准差表示，组间比较采用t检验，P<0.05表示数据间具有统计学差异。1402结果2.1构建过表达GAS2的慢病毒载体将人源GAS2基因的cDNA克隆于慢病毒载体中，GAS2由SFFV（spleenfocusformingvirus）启动子驱动。该载体具有内部核糖体进入位点（internalribosomeentrysite,IRES）/145黄色荧光蛋白（称为Venus）元件，能递送GAS2进入小鼠BaF3细胞。经westernblot检测+显示病毒侵染的子代细胞（YFP）中GAS2获得高表达（图1）。150图1GAS2过表达载体的成功构建Fig.1TheconstructionoflentiviralvectortodeliverGAS2intoBaF3cells.(A)SchematicgraphofthelentivrialvectortodeliverGAS2.(B)TheFACSanalysisprofileofthetransducedBaF3cellswasshown.(C)ThecontrolandGAS2overexpressedcellswereanalyzedwithwesternblot.1552.2GAS2过表达抑制BaF3/BCR-ABL细胞的Calpain活性表达BCR-ABL（GFP标记）的BaF3细胞具有不依赖mIL-3的生长能力，也可诱发小鼠的致死性白血病；因此是研究CML的良好模型。我们构建的慢病毒载体也递送GAS2进++入BaF3/BCR-ABL细胞。分选GFPYFP细胞并进行分析，发现与对照细胞相比GAS2获得160高表达并抑制这些细胞的Calpain活性（图2）。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn图2慢病毒载体递送GAS2至BaF3/BCR-ABL细胞165Fig.2.ThedeliveryofGAS2intoBaF3/BCR-ABLcells.(A)Therepresentativeprofileof+BaF3/BCR-ABL(GFP)cellsweretransducedwithGAS2lentiviralvector.(B)&(C)ThecontrolandGAS2overexpressedcellswereanalyzedwithwesternblotandCalpainactivityassay.2.3GAS2过表达对BaF3细胞体外生长的影响170经FACS分选各类BaF3细胞，包括对照（Ctrl）、GAS2、BCR-ABL和BCR-ABL/GAS2四组。分别检测它们的增殖和集落生成能力，结果显示GAS2不能显著增强BaF3细胞的体外生长（图3A），也不能显著增强BaF3/BCR-ABL细胞的生长（图3B）。175图3GAS2过表达对BaF3细胞体外生长的影响Fig.3.TheeffectofGAS2ontheinvitrogrowthofBaF3cells.(A)&(B)Theproliferationandcolony-formingcell(CFC)assaywereperformedtocomparethecontrol(Ctrl),GAS2expressed,BCR-ABLexpressedandBCR-ABL/GAS2co-expressedcells.1802.4GAS2增强BCR-ABL诱发小鼠白血病的能力虽然GAS2不能显著增强BaF3细胞的体外生长，我们继续进行细胞移植实验以研究4GAS2对BaF3细胞体内生长/诱发白血病能力的影响。注射上述4组细胞（2.5×10细胞/小鼠）至经致死剂量照射的Bal/BC小鼠（每组8只），在其后的一个月内进行观察小鼠体征185并称量体重。数据显示：BCR-ABL组小鼠全部发生白血病，而BCR-ABL/GAS2组小鼠也-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn全部发生白血病且发病时间显著早于BCR-ABL组（图4A）。对照和GAS2组在观察期能生存正常；观察期结束时，未在被处死的小鼠体内检出荧光细胞。表达BCR-ABL的两组小鼠脾脏明显较对照或单独表达GAS组增大（图4C），但未达到统计学差异。190图4GAS2增强BCR-ABL诱发小鼠白血病的能力Fig.4.GAS2enhancesBCR-ABLinducedleukemiainmice.(A)Kaplan-MeieranalysisofthemiceinjectedwithvariousBaF3cells.(B)Thebodyweightofthesefour-groupmicewas195monitored.(C)Therepresentativephotosofthespleensfromvariouslytreatedmicewereshown.2.5GAS2过表达导致Stat5蛋白积累[23]有关GAS2促白血病细胞生长的机制研究十分有限。Stat5是Calpain的作用底物，有[16]研究显示GAS2能通过抑制Calpain活性而导致Stat5表达的增高。因此，我们检测Stat5200的蛋白和基因表达。Westernblot检测显示过表达GAS2能增加BaF3和BaF3/BCR-ABL细胞中Stat5的表达，qRT-PCR检测则显示Stat5基因表达未发生显著变化；提示Stat5的积累由转录后调控所致（图5）。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn205图5GAS2过表达导致Stat5蛋白积累Fig.5.GAS2overexpressionleadstotheaccumulationofStat5protein.(A)TheStat5expressionwascomparedbetweenBaF3andBaF3/GAS2cells(leftpanel),themRNAexpressionofStat5wasassessedwithqRT-PCRaswell(rightpanel).(B)TheStat5expressionwas210comparedbetweenBaF3/BCR-ABLandBaF3/BCR-ABL/GAS2cells(leftpanel),themRNAexpressionofStat5wasassessedwithqRT-PCRaswell(rightpanel).2.6GAS2的表达随着白血病进程发展表达增强215本研究首次显示GAS2促进BCR-ABL诱发小鼠白血病的能力，部分揭示GAS2在CML+患者中异常高表达的生物学意义。本实验室已报道GAS2在慢性期CML患者CD34细胞中[18]较正常对照细胞表达显著增高，但尚不知我国急变期CML患者GAS2的表达状况。从苏州大学附属第一医院收集正常供体髓、慢性期CML患者和急变期CML患者骨髓，纯化+CD34细胞后进行qRT-PCR分析。这些患者的临床数据总结在表2.中。基因表达数据显示+220急变期患者CD34细胞中GAS2表达较慢性期患者显著增高（图6）。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn225表2.慢性髓细胞白血病患者的临床特征Table2.Thecharacteristicsofchronicmyeloidleukemiapatientsinthisstudy45CML-CPCML-BCTotal86No.Female41Male45Mean53.936.8AgeRange33~6528~46Age＜50,n(%)2(25.0)6(100)Age≥50,n(%)6(75.0)0(0)Mean107.94102.7219WBC,×10/LRange56.49~172.220~272.3Missing,n(%)0(0)1(16.7)Mean115.3892.802Hb,g/LRange84~15565~117Missing,n(%)0(0)1(16.7)Mean380.00113.4039Plt,×10/LRange109~89950~204Missing,n(%)0(0)1(16.7)12345,WBC,whitebloodcell;Hb,hemoglobin;Plt,platelet;CP,chronicphase;BC,blastcrisis.230图6GAS2在慢性期和急变期CML患者中的表达+Fig.6.TheexpressionofGAS2inCD34cellsfromhealthydonorsandCMLpatientsinCP+andBC.CD34cellfromhealthydonors(n=5),CMLpatientsinchronicphase(CP,n=8)and235blastcrisis(BC,n=6)werepurifiedwithFACS,andtheexpressionofGAS2wasassessedwithqRT-PCR.3讨论包括本课题组在内的多项报道表明GAS2在多种恶性血液病患者干/祖细胞中较正常对-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[17-19]240照细胞显著增高，强烈提示GAS2在白血病发生和发展过程中起重要作用。此外，也有文献报导抑制GAS2表达（RNAi或表达GAS2的显性负性突变体GAS2DN）可以抑制白血[18,19,22]病细胞的体内外生长；但尚未有文献研究GAS2过表达能否促进正常血液细胞的生长或直接促进白血病细胞的生长。本研究中我们首先构建慢病毒载体过表达GAS2，westernblot显示该蛋白获得预期的高245表达，且也抑制细胞中的Calpain活性。令我们感到意外的是，GAS2过表达并未在体外直接促进BaF3细胞或BaF/BCR-ABL细胞的生长。然而，当我们进行体内实验时发现，虽然GAS2未能恶性转化BaF3细胞，但GAS2增强BCR-ABL的恶性转化能力，使发病时间显著缩短。这个结果首次表明GAS2具有促进血液细胞恶性转化的能力。我们也检测了GAS2[16]过表达细胞中Stat5的表达；与已有文献一致，实验中也观察到Stat5蛋白的表达增强。250因此，Stat5表达的增高可能是GAS2促白血病细胞生长的一个因素。两组独立研究都显示[20,21]GAS2在CML疾病进展过程中表达增高，但对于我国患者的状况尚无研究报道。本研+究中我们使用苏州大学附属第一医院收集的少量患者进行检测，结果显示急变期患者CD34+细胞中GAS2表达较慢性期患者CD34细胞显著增高。GAS2可促进BaF3/BCR-ABL细胞诱发白血病能力的实验结果也提示GAS2可能参与CML的急变过程。255综上，本研究提示深入研究GAS2在白血病中的功能与机制有助于更好地认识白血病分子致病机制，可能为改善这些疾病的治疗提供新策略。4结论本研究表明过表达GAS2增强BCR-ABL恶性转化BaF3细胞的能力，且伴有Stat5表达的增高；提示GAS2在白血病发生、发展过程中可能具有重要功能。深入研究GAS2在白血260病细胞中的功能与机制，有望为改善疾病治疗提供新的理论依据和实验基础。致谢感谢苏州大学附属第一医院周海侠医师给予的大力支持。[参考文献](References)265[1]SherbenouDW,DrukerBJ.ApplyingthediscoveryofthePhiladelphiachromosome[J].JClinInvest,2007,117(8):2067-2074.[2]JiangX,ZhaoY,ForrestD,SmithC,EavesA,EavesC.Stemcellbiomarkersinchronicmyeloidleukemia[J].DisMarkers,2008,24(4-5):201-216.[3]GHeller,TTopakian,CAltenberger,SCerny-Reiterer,SHerndlhofer,BZiegler,PDatlinger,KByrgazov,C270Bock,CMannhalter,GHörmann,WRSperr,TLion,CCZielinski,PValent,SZöchbauer-Müller.Next-generationsequencingidentifiesmajorDNAmethylationchangesduringprogressionofPh+chronicmyeloidleukemia[J].Leukemia,2016,30(9):1861-1868.[4]DrukerBJ,GuilhotF,O"BrienSG,GathmannI,KantarjianH,GattermannN,DeiningerMW,SilverRT,GoldmanJM,StoneRM,CervantesF,HochhausA,PowellBL,GabriloveJL,RousselotP,ReiffersJ,Cornelissen-10- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn275JJ,HughesT,AgisH,FischerT,VerhoefG,ShepherdJ,SaglioG,GratwohlA,NielsenJL,RadichJP,SimonssonB,TaylorK,BaccaraniM,SoC,LetvakL,LarsonRA.IRISInvestigators.Five-yearfollow-upofpatientsreceivingimatinibforchronicmyeloidleukemia[J].NEnglJMed,2006,355(23):2408-2417.[5]O"HareT,ZabriskieMS,EiringAM,DeiningerMW.Pushingthelimitsoftargetedtherapyinchronicmyeloidleukaemia[J].NatRevCancer,2012,12(8):513-526.280[6]ChuS,McDonaldT,LinA,ChakrabortyS,HuangQ,SnyderDS,BhatiaR.Persistenceofleukemiastemcellsinchronicmyelogenousleukemiapatientsinprolongedremissionwithimatinibtreatment[J].Blood,2011,118(20):5565-5572.[7]CorbinAS,AgarwalA,LoriauxM,CortesJ,DeiningerMW,DrukerBJ.HumanchronicmyeloidleukemiastemcellsareinsensitivetoimatinibdespiteinhibitionofBCR-ABLactivity[J].JClinInvest,2011,285121(1):396-409.[8]HamiltonA,HelgasonGV,SchemionekM,ZhangB,MyssinaS,AllanEK,NicoliniFE,Müller-TidowC,BhatiaR,BruntonVG,KoschmiederS,HolyoakeTL.ChronicmyeloidleukemiastemcellsarenotdependentonBcr-Ablkinaseactivityfortheirsurvival[J].Blood,2012,119(6):1501-1510.[9]AbrahamSA,HopcroftLE,CarrickE,DrotarME,DunnK,WilliamsonAJ,KorfiK,BaqueroP,ParkLE,290ScottMT,PellicanoF,PierceA,CoplandM,NourseC,GrimmondSM,VetrieD,WhettonAD,HolyoakeTL.Dualtargetingofp53andc-MYCselectivelyeliminatesleukaemicstemcells[J].Nature,2016,534(7607):341-346.[10]BrancoliniC,BottegaS,SchneiderC.Gas2,agrowtharrest-specificprotein,isacomponentofthemicrofilamentnetworksystem[J].JCellBiol,1992,117(6):1251-1261.[11]ZhangT,DayanandanB,RouillerI,LawrenceEJ,MandatoCA.Growth-arrest-specificprotein2inhibitscell295divisioninXenopusembryos[J].PLoSOne,2011,6(9):e24698.[12]BenettiR,DelSalG,MonteM,ParoniG,BrancoliniC,SchneiderC.ThedeathsubstrateGas2bindsm-calpainandincreasessusceptibilitytop53-dependentapoptosis[J].EMBOJ,2001,20(11):2702-2714.[13]PetroulakisE,ParsyanA,DowlingRJ,LeBacquerO,MartineauY,BidinostiM,LarssonO,AlainT,RongL,MamaneY,PaquetM,FuricL,TopisirovicI,ShahbazianD,LivingstoneM,Costa-MattioliM,TeodoroJG,300SonenbergN.p53-dependenttranslationalcontrolofsenescenceandtransformationvia4E-BPs[J].CancerCell,2009,16(5):439-446.[14]KondoY,ShenL,ChengAS,AhmedS,BoumberY,CharoC,YamochiT,UranoT,FurukawaK,Kwabi-AddoB,GoldDL,SekidoY,HuangTH,IssaJP.GenesilencingincancerbyhistoneH3lysine27trimethylationindependentofpromoterDNAmethylation[J].NatGenet,2008,40(6):741-750.305[15]BenettiR,CopettiT,Dell"OrsoS,MelloniE,BrancoliniC,MonteM,SchneiderC.Thecalpainsystemisinvolvedintheconstitutiveregulationofbeta-cateninsignalingfunctions[J].JBiolChem,2005,280(23):22070-22080.[16]HjortEE,HuangW,HuL,EklundEA.Bcr-ablregulatesStat5throughShp2,theinterferonconsensussequencebindingprotein(Icsbp/Irf8),growtharrestspecific2(Gas2)andcalpain[J].Oncotarget,2016,3107(47):77635-77650.[17]GuglielmelliP,ZiniR,BoganiC,SalatiS,PancrazziA,BianchiE,MannelliF,FerrariS,LeBousse-KerdilèsMC,BosiA,BarosiG,MigliaccioAR,ManfrediniR,VannucchiAM.MolecularprofilingofCD34+cellsinidiopathicmyelofibrosisidentifiesasetofdisease-associatedgenesandrevealstheclinicalsignificanceofWilms"tumorgene1(WT1)[J].StemCells,2007,25(1):165-173.315[18]ZhouH,GeY,SunL,MaW,WuJ,ZhangX,HuX,EavesCJ,WuD,ZhaoY.Growtharrestspecific2isup-regulatedinchronicmyeloidleukemiacellsandrequiredfortheirgrowth[J].PLoSOne,2014,9(1):e86195.[19]SunL,ZhouH,LiuH,GeY,ZhangX,MaW,WuD,ZhaoY.GAS2-Calpain2axiscontributestothegrowthofleukemiccells[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai),2015,47(10):795-804.[20]JanssenJJ,KlaverSM,WaisfiszQ,PasterkampG,deKleijnDP,SchuurhuisGJ,OssenkoppeleGJ.320IdentificationofgenespotentiallyinvolvedindiseasetransformationofCML[J].Leukemia,2005,19(6):998-1004.[21]RadichJP,DaiH,MaoM,OehlerV,SchelterJ,DrukerB,SawyersC,ShahN,StockW,WillmanCL,FriendS,LinsleyPS.Geneexpressionchangesassociatedwithprogressionandresponseinchronicmyeloidleukemia[J].ProcNatlAcadSciUSA,2006,103(8):2794-2799.[22]HuangW,ZhouW,SaberwalG,KoniecznaI,HorvathE,KatsoulidisE,PlataniasLC,EklundEA.Interferon325consensussequencebindingprotein(ICSBP)decreasesbeta-cateninactivityinmyeloidcellsbyrepressingGAS2transcription[J].MolCellBiol,2010,30(19):4575-4594.[23]OdaA,WakaoH,FujitaH.Calpainisasignaltransducerandactivatoroftranscription(STAT)3andSTAT5protease[J].Blood,2002,99(5):1850-1852.-11-'