牛传染性鼻气管炎病毒三基因缺失突变株的构建.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn牛传染性鼻气管炎病毒三基因缺失突变株#的构建1,22,311,2,3**李程，陈颖钰，索朗斯珠，郭爱珍5（1.西藏大学农牧学院动物科学学院，西藏林芝860000；2.华中农业大学动物医学院，湖北武汉430070；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，湖北武汉，430070）摘要：牛传染性鼻气管炎是由牛疱疹病毒Ⅰ型（BoHV-1）引起的一种牛的传染病，可导致10严重的经济损失。疫苗接种是用于防控该病的重要手段，但现有疫苗在多个方面都有改进的余地。本实验利用pBoHV-1BAC载体和四次RedE/T重组，依次构建了BoHV-1gN（-CT-）、BoHV-1gN-（CT-30-32-）、BoHV-1gN-TK-和BoHV-1gN-TK-gG-基因缺失突变株，其中gN缺失了胞外区30-32位氨基酸、胞质尾区CT端，TK基因缺失了1079bp，gG基因缺失了1335bp。pBoHV-1gN-TK-gG-经磷酸钙法转染MDBK细胞后，出现细胞病变，成功15拯救出三基因缺失病毒株BoHV-1gN-TK-gG-。研究结果为牛传染性鼻气管炎新型基因缺失标记疫苗的开发奠定了基础。关键词：牛传染性鼻气管炎；牛疱疹病毒I型；基因缺失疫苗；gN；TK；gG中图分类号：请查阅《中国图书馆分类法》20ConstructionofaTripleGeneDeletedMutantBoHV-1gN-/TK-/gG-1,22,311,2,3LiCheng,ChenYingyu,Suolangsizhu,GuoAizhen(1.CollegeofAnimalScienceofXiZangAgriculturalandAnimalHusbandryUniversity,TibetLinzhi860000;252.CollegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,HubeiWuhan430070;3.StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,HuazhongAgriculturalUniversity,HubeiWuhan,430070)Abstract:BovineinfectiousrhinotracheitisisabovineinfectiousdiseasecausedbybovineherpesvirustypeI(BoHV-1),whichcanleadtoseriouseconomiclosses.Vaccinationisanimportantmeanto30preventandcontrolthisdisease.However,thecurrentvaccinesremaintobeimprovedinmanyways.Inthisstudy,BoHV-1gN-（CTnull）、BoHV-1gN-（CT/30-32null）、BoHV-1gN-TK-andBoHV-1gN-TK-gG-weresequentiallyconstructedbyusingpBoHV-1BACvectorandfourroundsofRedE/Trecombination.ThegNwasdeletedofextracellulardomain(including9bp),thepartofcytoplasmictail(CT)(covering7bp),whileTKgenewasdeletedof1079bp,andgGgeneof1335bp.TheMDBK35cellsweretransfectedbythefinalrecombinantplasmidpBoHV-1gN-TK-gG-withcalciumphosphatemethodandthevirusreplicationwasobservedinthecellsshownbygreenfluorescenceindicatingthattheviralmutantBoHV-1gN-TK-gG-wassuccessfullyrescued.Thisresultprovidesthebasisforfurtherdevelopmentofnovelvaccinewithtriplegenedeletedmarkeragainstbovineinfectiousrhinotracheitis.40Keywords:IBR；BoHV-1；gene-deletedvaccine；gN；TK；gG基金项目：高校博士点基金（项目编号：20130146110003）；现代农业（肉牛/牦牛）产业技术体系专项资金（项目编号：CARS-38）；国家重点研发计划（项目编号：2016YFD0500906）。作者简介：李程（1990-），男，预防兽医学方向硕士研究生通信联系人：郭爱珍（1965-），女，博士，教授，现代农业（肉牛/牦牛）产业技术体系岗位科学家，从事兽医传染病防控理论和技术研究.E-mail:aizhen@mail.hzau.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言牛传染性鼻气管炎（Infectiousbovinerhinotracheitis,IBR）是由牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovine45herpesvirus-1,BoHV-1）引起的以呼吸道炎症、生殖道炎症、眼炎等为主要临床特征的接触[1]性传染病，给养牛业造成了巨大的经济损失。IBR呈世界性分布，除意大利（波尔查诺省）、奥地利、挪威、芬兰等少数国家和地区已控制或消灭该病外，其他国家均有该病的报道。我国各地均有IBR报道，流行呈上升趋势。疫苗接种是控制和根除牛传染性鼻气管炎的重要手段，基因缺失标记疫苗因具有血清学-50免疫标记（如gE基因缺失标记疫苗）而被欧美发达国家广泛使用。我国尚无商品化基因缺[2-3]失标记疫苗。为了对我国牛传染性鼻气管炎进行有效控制，本实验室前期成功构建了BoHV-1--[4]TK/gG双基因缺失疫苗，临床试验表明缺失株毒力明显减弱且免疫原性良好。本研究拟通[5]过Red重组方法，以实验室分离的BoHV-1HB06为亲本毒株，进一步缺失BoHV-1免疫55抑制关键基因gN，以期构建一个免疫原性或安全性更加优良的三基因缺失疫苗，为开发高效安全的牛传染性鼻气管炎疫苗的提供基础。1实验材料与方法1.1菌株、质粒和载体牛肾传代CL21型细胞(Madin-Darbybovinekidney，MDBK)购于中国兽医药品监察所，60由本实验室保存。BoHV-1HB06毒株由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室反刍动物病原室分离和保存。大肠杆菌（E.coli）GS1783和pEPkans由浙江省农科院畜牧兽医研究所张存教授馈赠，由本实验室保存。65辅助质粒pBICP0由华中农业大学动物医学院刘正飞教授提供，由本实验室保存。pBoHV-1BAC载体为本实验室构建。1.2引物的设计与合成根据GenBank中已发布的BoHV-1（登录序号：AJ004801）基因序列，按照两步RED重组方法，用PrimerPremier6.0软件设计gN基因两个位点（CT端和30-32AA）、TK基因、70gG基因上下游同源臂缺失引物（delefor/rev）和鉴定引物（seq-f、seq-r）。同源臂引物由上海生物工程公司合成；鉴定引物由武汉昆泰锐生物技术公司合成（表1）。表1本研究所用引物信息Tab.1Primersusedinthisstudy-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn引物名称序列(5’-3’)产物大小（bp）gN-CTdeleP1:AATGGTCGCCGTGGCCCTGTACGCGTACGGGCTTTGCTTTTA1100for/revAGCGCCAGCGGGCCCAATAGGATGACGACGATAAGTAGGGP2:CGCCCCCGCGACTCCTTTTTATTGGGCCCGCTGGCGCTTAAAAGCAAAGCCCGTACGCGTCAACCAATTAACCAATTCTGATTAGgN-30-32deleP3:TGCCATCGTGCGCGGCCGCGACCCCCTGCTAGACGCGATG1100for/revGGGGCAATGGACTTTTGGAGAGGATGACGACGATAAGTAGGGP4:CGCGCGCGTAGCAGCCTGCGCTCCAAAAGTCCATTGCCCCCATCGCGTCTAGCAGGGGGTCAACCAATTAACCAATTCTGATTAGgG-deleP5:GCGAGCGAACGCGAGCGCAAGCGCGAGCACACGACTGCGA1100for/revTCTCGCCGGCACCCCACGCCGCCgccagtgttacaaccaattaaCCP6:AACGCGGGACAGCGGGGTCGGGGCGGCGTGGGGTGCCGGCGAGATCGCAGTCGTGTGCTCGCGtagggataacagggtaatcgatttTK-deleP7:TGGCGTACTGGCGCACGATGTTTGGTACGGACGCCTTAAGT1100for/revGTACCCGGGCGGCGGGACGGGCgccagtgttacaaccaattaaCCP8:CCAGGCGTGAACCGCGGGCAAGCCCGTCCCGCCGCCCGGGTACACTTAAGGCGTCCGTACCAAtagggataacagggtaatcgatttgN-seq-f/rP9:GTTTCATCTCGCTTTGCTGCTG600P10:CTGTTTTCTCGCACCCAAAGGTCTK-seq-f/rP11:ACGGGCTGGGAAAGACAACAAGG247P12:GCGGACACGTCCAGCACGAACAgG-seq-f/rP13:CCGACCGCCTCCTACACCAGATGCT523P14:GGGTGTAGGCAAGCTCACCGCAACG75注:缺失引物由目的基因同源臂与kan整合位点序列（kan-secⅠ）组成，后者以下划线标出。1.3基因缺失株的构建-1.3.1pBoHV-1gN（CT）构建以pEPkans基因组DNA为模板，用gN-CTdelefor/rev基因敲除引物扩增出含有目的基因同源臂的kan片段，并利用PCR纯化试剂盒（TaKaRa，大连，中国）进行产物回收及纯80化。将回收产物用DpnⅠ37℃酶切2h，经DNA琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收PCR产物，即为含短同源臂CT-kan片段。PCR反应程序：95℃5min；94℃15s，45℃45s，72℃1min，10循环；94℃15s，60℃15s，72℃1min，25循环；72℃10min，16℃20min。将CT-kan片段100ng与50l转化有BAC质粒pBoHV-1的GS1783感受态混合，利用Bio-Rad电转仪进行电转化，电击条件：2500V，25F，200Ω，电击。加入1ml无抗LB培85养液，32℃，200r/min震荡培养2h，涂布含氯霉素和卡那霉素的双抗性LB平板，32℃培养30h。挑取单菌落，在含氯霉素和卡那霉素双抗性的培养液中，32℃过夜培养。取菌液提取质粒，选取OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒为模板，用鉴定引物gN-seq-f/seq-r（表1）进行PCR鉴定，扩增产物应为1656bp。鉴定正确的菌液命名为E.coliGS1783pBoHV-1gN-CT：：kan。PCR反应程序：95℃5min；94℃1min，61.7℃90s，72℃2min，35循环；72℃10min；9016℃20min。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn取GS1783pBoHV-1gN-CT：：kan菌液1ml，32℃震荡过夜。转接至3ml含氯霉素抗性的LB培养基，32℃，180r/min摇菌3h，加入2%阿拉伯糖LB培养基3ml，震荡1h诱导-5表达I-SceI核酸内切酶；转入42℃摇床，180r/min摇菌30min进行Red重组。取菌液10涂于含氯霉素和卡那霉素的双抗性LB平板，32℃培养30h。将生长良好的单克隆菌落点种95于含氯霉素和卡那霉素双抗性的LB平板上，32℃培养30h。挑取氯霉素和卡那霉素双抗性的平板上不生长，而在氯霉素平板上生长的单克隆菌落，用含氯霉素抗性的LB培养液培养。保菌后其余菌液提取质粒，选取OD260/OD280在1.8-2.0之间的质粒，用引物gN-seq-f/seq-r（表1）进行PCR鉴定，扩增产物应为556bp。PCR程序如上。PCR扩增产物送武汉昆泰-瑞公司测序，序列与Blast序列比对，鉴定正确的菌液命名为E.coliGS1783pBoHV-1CT。---1001.3.2pBoHV-1gN(CT30-32)构建以pEPkan-s基因组DNA为模板，用gN-30-32delefor/rev基因敲除引物扩增出含短同源-臂30-32-kan片段。将30-32-kan片段与GS1783BoHV-1CT感受态电转，电转、培养和抗性筛选程序同1.3.1。提取质粒后，用鉴定引物gN-seq-f/seq-r（表1）进行PCR鉴定，扩增产-物应为1649bp。鉴定正确的菌液命名为E.coliGS1783pBoHV-1CT30-32：：kan。经阿拉伯105糖诱导后，挑取单克隆进行PCR扩增，扩增产物应为549bp，产物测序。鉴定正确的菌液-命名为E.coliGS1783pBoHV-1gN。--1.3.3pBoHV-1gNTK构建以pEPkan-s基因组DNA为模板，用TKdelefor/rev基因敲除引物扩增出含短同源臂-TK-kan片段。将TK-kan片段与GS1783pBoHV-1gN感受态电转，电转、培养和抗性筛选110程序同1.3.1。提取质粒后，用鉴定引物TK-seq-f/seq-r（表1）进行PCR鉴定，扩增产物应-为1347bp。鉴定正确的菌液命名为E.coliGS1783pBoHV-1gNTK：：kan。经阿拉伯糖诱导后，挑取单克隆进行PCR鉴定，扩增产物应为247bp，产物测序。鉴定正确的菌液命名为--E.coliGS1783pBoHV-1gNTK。---1.3.4pBoHV-1gNTKgG构建115以pEPkan-s基因组DNA为模板，用gGdelefor/rev基因敲除引物扩增出含短同源臂--gG-kan片段。将gG-kan片段与GS1783BoHV-1gNTK感受态电转，电转、培养和抗性筛选程序同1.3.1。提取质粒后，用鉴定引物gG-seq-f/seq-r（表1）进行PCR鉴定，扩增产物--应为1623bp。鉴定正确的菌液命名为E.coliGS1783pBoHV-1gNTKgG：：kan。经阿拉伯糖诱导后，挑取单克隆进行PCR扩增，扩增产物应为523bp，产物测序。鉴定正确的菌液---120命名为E.coliGS1783pBoHV-1gNTKgG。1.4重组病毒的拯救将MDBK细胞在6孔细胞培养板（Corning，NYC，USA）长成70%丰度，将pBoHV-1-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn---gNTKgG用磷酸钙转染法转染MDBK细胞，置37℃培养箱5%CO2条件下培养48h后。如果在光学显微镜下观察，可发现细胞病变；在荧光显微镜下观察，可见绿色荧光，则显示---125成功拯救出病毒，命名为BoHV-1gNTKgG。2结果-2.1pBoHV-1gN（CT）重组质粒的鉴定PCR扩增含短同源臂CT-kan片段为1100bp（图1A），电转化含pBoHV-1的GS1783rr感受态细胞后，获得具有Cmkan的重组菌。从重组菌提取质粒进行PCR鉴定，扩增产物-130为1656bp（图1B），与gNCT：：kan的预期大小一致，表明CT-kan片段取代了CT片段。rs重组菌经阿拉伯糖诱导后，获得Cmkan的重组菌。提取质粒，用鉴定引物gN-seq-f/r进行PCR扩增，扩增产物大小为556bp（图1C），与预期大小一致，表明gN基因的CT端缺失-成功。缺失gN基因CT端的BAC质粒命名为pBoHV-1gN（CT）。-135图1BoHV-1gN（CT）的PCR鉴定Fig.1pBoHV-1deletionofgNCTnullidentifiedbyPCR-2.2BoHV-1gN缺失鉴定-PCR扩增含短同源臂30-32-kan片段为1100bp（图2A），电转化GS1783BoHV-1CTrr感受态细胞后，获得具有Cmkan的重组菌。从重组菌提取质粒进行PCR鉴定，扩增产物--140为1649bp（图2B），与gNCT30-32：：kan的预期大小一致，表明30-32-kan片段取代了rs30-32AA。重组菌经阿拉伯糖诱导后，获得Cmkan的重组菌。提取质粒，用鉴定引物gN-seq-f/r进行PCR扩增，扩增产物大小为549bp（图2C），与预期大小一致，表明gN基-因的30-32端缺失成功。缺失gN基因(CT端和30-32AA)的BAC质粒命名为pBoHV-1gN。-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn-145图2BoHV-1gN的鉴定-Fig.2IdentificationofgNdeletioninpBoHV-1--2.3BoHV-1gNTK缺失鉴定-PCR扩增含短同源臂TK-kan片段为1100bp（图3A），电转化GS1783pBoHV-1gNrr150感受态细胞后，获得具有Cmkan的重组菌。从重组菌提取质粒进行PCR鉴定，扩增产物-为1347bp（图3B），与gNTK：：kan的预期大小一致，表明TK-kan片段取代了TK基因。rs重组菌经阿拉伯糖诱导后，获得Cmkan的重组菌。提取质粒，用鉴定引物TK-seq-f/r进行PCR扩增，扩增产物大小为247bp（图3C），与预期大小一致，表明TK基因缺失成功。--缺失TK基因的BAC质粒命名为pBoHV-1gNTK。155--图3BoHV-1gNTK的PCR鉴定Fig.3pBoHV-1deletionofTKidentifiedbyPCR---2.4BoHV-1gNTKgG缺失鉴定--PCR扩增含短同源臂gG-kan片段为1100bp（图4A），电转化GS1783pBoHV-1gNTKrr160的感受态细胞后，获得具有Cmkan的重组菌。从重组菌提取质粒进行PCR鉴定，扩增产--物为1623bp（图4B），与gNTKgG：：kan的预期大小一致，表明gG-kan片段取代了gGrs基因。重组菌经阿拉伯糖诱导后，获得Cmkan的重组菌。提取质粒，用鉴定引物gG-seq-f/r进行PCR扩增，扩增产物大小为523bp（图4C），与预期大小一致，表明gG基因缺失成---功。缺失gG基因的BAC质粒命名为pBoHV-1gNTKgG。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn165---图4BoHV-1gNTKgG的鉴定Fig.4pBoHV-1deletionofgGidentified2.5重组病毒的拯救---170测序正确的pBoHV-1gNTKgG用乙醇沉淀纯化后，经磷酸钙法转染MDBK细胞拯救病毒。48h后荧光显微镜观察病变，如图5所示：细胞产生CPE和绿色荧光，表明该质粒可以启动病毒增殖，说明病毒拯救成功。图5重组病毒的拯救（10×10）175Fig.5Rescueofrecombinantvirus3分析讨论在已报道的BoHV-1基因缺失株中，大多数为单基因或双基因缺失。基因缺失越多，其突变株的回复突变可能性越小，因而安全性越高；然而，相应的免疫效力也可能降低。因此，-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[6]靶基因选择显得尤其重要，其中非必需、免疫抑制性基因是最理想的靶标之一。基于这一--180原理，本研究在前期构建的BoHV-1TK/gG双基因缺失疫苗基础上，选择免疫抑制关键基因gN作为进一步缺失的靶基因。BoHV-1gN可通过结合和降解TAP、阻断MHC-1与抗原复合体的装配，从而阻止CD8+T细胞杀死感染细胞、导致病毒逃避和抑制免疫清除作用活[7]性。gN胞外区第30-32AA与胞质尾区（CT端）是造成免疫抑制的关键位置，当CT端与30-32AA同时缺失时，BoHV-1下调MHC-1和抑制TAP的作用几乎会消失，病毒诱导的免[8]185疫反应得到增强，保护效力也得到提高。由于缺失gN全基因将使病毒丧失增殖能力，因此，本研究选择了同时缺失胞外区第30-32AA与胞质尾区（CT端）。[9]虽然进行基因敲除的方法有多种，但本研究证实，利用BAC载体是一种高效方法。[10]---在pBoHV-1BAC载体基础上，利用四次RedE/T重组技术，构建了pBoHV-1gNTKgG三基因（四位点）缺失BAC载体，PCR扩增产物大小和扩增产物序列鉴定均证明重组BAC---190载体pBoHV-1gNTKgG构建正确；进一步转染MDBK细胞后成功拯救出BoHV-1---gNTKgG病毒。虽然该重组病毒的生物学特征、安全性和免疫效力有待深入验证，但研究结果为牛传染性鼻气管炎新型基因缺失标记疫苗的开发奠定了重要基础。[参考文献](References)195[1]JonesC,ChowdhuryS.Areviewofthebiologyofbovineherpesvirustype1(BHV-1),itsroleasacofactorintherespiratorydiseasecomplexanddevelopmentofimprovedvaccines[J].AnimalHealthResearchReviews,2007,8(02):187-205.[2]ButcgiNB,JonesC,PerezS,etal.EnvelopeproteinUs9isrequiedfortheanterogradetransportofbovineherpesvirustype1fromtrigeminalgangliatonoseandeyeuponreactivation[J].Journalof200neurovirology,2007,13(4):384-388.[3]李程，陈颖钰，索朗斯珠等.牛传染性鼻气管炎的流行语防控进展[J].中国奶牛，2015，（17）：40-43.[4]ZhangM,FuS,DengM,etal.Attenuationofbovineherpesvirustype1bydetectionofitsglycoproteinGandtkgenesandprotectionaganistvirulentviralchallenge[J].Vaccine,2011,29:8943-8950.[5]TishcherBK,vonEinemJ,KauferB,etal.Two-stepred-mediatedrecombinationforversatilehigh-efficiency205markerlessDNAmaniplationinEscherichiacoli[J].Biotechniques,2006,40(2):191.[6]RobinsonKE,MeersJ,GracelJL,etal.Theessentialandnon-essentialgenesofBovineherpesvirus1[J].TheJournaeyofgeneralvirology,2008,89:2851-2863.[7]RudolphJ，SeyboldtC,GranzowH,etal.Thegene10(UL49.5)productofequineherpesvirus1isnecessaryandsufficientforfunctionalprocessingofglycoproteinM[J].Journalofvirology,2002,76(6):2952-2963.210[8]MesserleM,CrnkovicI,HammerschmidtW,etal.Clonngandmutagenesisofaherpesvirusgenomeasaninfectiousbacterialartificalchromosome[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofScineses,1997,94(26):14759-14763.[9]ShizuyaH,BirrenB,KimU,etal.Cloningandstablemaintenanceof300-kilobase-pairfragentsofhumanDNAinEscherichiacoliusinganF-factor-basedvector[J].ProceedingdoftheNationalAcademyof215Scineces,1992,89(18):8794-8797.[10]TishcherBK,KauferBB.Viralbacterialartificalchromosome:generation,mutagenesis,andremovalofmini-Fsequences[J].BioMedResearchInternational,2011,2012:472537.-8-'