牛蒡叶提取物对木腐菌抑制能力试验研究.pdf 10页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#牛蒡叶提取物对木腐菌抑制能力试验研究**荣宾宾，徐国祺，王立海，刘泽旭（东北林业大学工程技术学院，哈尔滨150040）5摘要：研究了牛蒡叶中抑制木腐菌活性成分的快速提取工艺及其抑菌性能。在提取预实验和单因素实验的基础上，采用响应曲面法对牛蒡叶中活性成分进行优化提取，以抑菌效果为指标的均匀设计对响应曲面结果进行验证，并确定其对木材腐朽菌能力。实验结果表明：直接-1采用酸性水进行提取要优于其他方式，并且在响应曲面四因素三水平优化后，在30mL•g、1052℃、77min和pH值=2条件下提取率达到最大值44.81%，与模型理论值差异为2.08%；均匀设计验证试验中，各实验点的提取率与响应模型平均差异为-0.21%，与响应曲面预测值基本一致，并且提取物抑制白腐菌的效果较预实验提高了16.47%；此方法得到的提取物对白腐菌和褐腐菌的最低抑菌浓度达到2.42%和3.15%。关键词：牛蒡叶；抑菌；白腐菌；响应曲面；均匀设计15中图分类号：Q946;R284.2Burdockextractonexperimentalstudyofwood-rotfungiinhibitionRONGBinbin,XUGuoqi,WANGLihai,LIUZexu20(EngineeringandTechnologyofCollege,NortheastForestryUniversity,Harbin150040)Abstract:Thepurposeofthisstudywastodeterminetherapidextractionprocessoftheactiveingredientfromburdockleavesanditsinhibitionperformanceofwood-rotfungus.Onthebasisofthepreliminaryexperimentandthesinglefactorexperiments,tooptimizetheactivecomponentsofburdockleavesextractwithResponseSurfaceMethodology(RSM).TheresultsoftheRSM25wereverifiedbyUniformDesignwithitsantifungalexperiments,andconfirmeditsuntifungalabilitiesofwood-decayfungus.Experimentalresultsshowdedthatextractionefficiencyunder-1correctionconditionswhichwasat30mL•g,52℃,77minandpH=2was44.81%afterwhichthefourfactorsandthreelevelsofRSMoptimizationexperiments,andthedifferencewiththetheoreticalvalueofRSMmodelwas2.08%.IntheverifyexperimentsofUniformDesign,the30meandifferencewithresponsesurfacemodelwas-0.21%,andconsisitentedwithpredictedvalueofRSM,andtheinhibitoryeffectofwhite-rotfunguswashigherthanthepreliminaryexperimentof16.47%,andit"sminimuminhibitoryconcentrationswhichcontroledthewhite-rotfungusandbrown-rotfungiare2.42%and3.15%.Keywords:burdockleaves;anti-fungal;white-rotfungi;ResponseSurfaceMethodology;35UniformDesign0引言为了保护木材并延长木材的使用年限，通常对其进行防腐处理，以实现节约森林资源的40目的。但目前国内外商业用木材防腐剂（季铵铜、铜唑类等）或多或少都含有对生态环境和[1]生物有害的物质。而从植物中提取的抑菌活性物质，具有毒性低、残留少等优点，逐渐成[1][2][3-4]为木材防腐领域的研究热点。例如，白坚木树皮、含羞草树皮、刺槐心材、樟树叶、[5-6]楝树叶和籽等提取物均有较好的抑制木材腐朽菌能力，有望替代化学防腐剂。本研究中使用的牛蒡(ArctiumLappaL.)，其根和叶中含有黄酮类、糖类、多酚类等多种抑菌活性物基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（20130062110001）作者简介：荣宾宾（1989-），男，在读硕士，木材防腐通信联系人：王立海，男，教授，主要研究方向：森林工程.E-mail:lihaiwang@yahoo.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[7-9][10-11]45质，具有良好的抗氧化、抑菌、抗衰老、降血糖等生物活性。牛蒡根和叶、金银花、[12-13][14-17]杜仲、咖啡豆等都是多酚类抗菌物质绿原酸(chlorogenicacid,CHA)的主要经济原[18]料。陈世雄等研究发现，牛蒡根中含有较高含量的绿原酸、牛蒡寡糖等多种抑菌活性物[19][20]质，绿原酸对植物致病菌有抑制作用。刘世民等在对牛蒡叶中绿原酸提取优化过程中，其含量达到3.05%。而作为农业生产废弃物的牛蒡叶在抑制木材腐朽菌的研究较少。[21]50植物内含有的先天抗菌素和溢泌物质共同作用使植物具有广谱抗菌活性，因此植物体内含有的抑菌活性物质的差异导致其对不同菌种抑制能力存在差异。目前植物源活性物质的提取过程多为单体提取优化并进行单体抑菌研究，对于植物源活性物质的整体研究相对较少。因此，本文以牛蒡(ArctiumLappaL.)叶为研究对象，采用响应曲面优化、均匀设计验证相结合的方式，确定了牛蒡叶中水溶性活性成分的高效提取方式，获得抑制木材腐朽菌活性55物质，为应用到木材中的生物源防腐剂的研究提供合理有效的抑菌物质和提取方式。1实验材料本实验菌种为白腐菌-彩绒革盖菌(Coriolusversicolor,C.v)、褐腐菌-密粘褶菌(Gloceophyllumtrabeum,G.t)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，其中白腐菌为提取效果指示菌。60牛蒡叶，6月采自江苏省徐州市沛县栖山镇，采用室内阴干并过20目筛。实验试剂：冰醋酸、乙醇等分析纯。2实验原理及方法2.1提取预实验首先，确定溶剂的差异导致提取物抑菌能力差异，进一步优化提取溶剂。先将10g牛蒡[18-20]65叶粉末，以1:19（料液比）的比例分别加入蒸馏水和酸性水溶液（pH值在2-3之间），在50℃水浴搅拌提取1h；过滤后，减压浓缩；将酸性水提取物用乙醇溶剂进行二次提取，浓缩后分别获得提取剩余物和溶解于乙醇中的物质。将经蒸馏水、酸性水、乙醇提取的物质和提取剩余物分别配置成的10%的水溶液，以白腐菌为抑菌效果指示菌，进行牛津杯抑菌实验，三天后测量抑菌圈直径（其他抑菌实验测量时间亦是三天后）。702.2单因素实验进行单因素实验获得响应曲面各自变量提取范围。选取提取温度、液料比、提取时间以[7-9,18--23]及溶剂pH值四个因素作为研究的自变量，分别测量各因素对牛蒡叶提取率的影响。2.3响应曲面优化实验在单因素实验的基础上，采用响应曲面Box-Behnken组合原理进行四因素三水平优化实75验，其并借助Designexpert(V8.0.6)软件对实验进行设计和分析，以牛蒡叶提取率为响应值，料液比、提取温度、提取时间、溶剂pH值为自变量，进行响应曲面实验，以提高牛蒡叶的提取率，水平设计见表1。表1响应曲面实验水平设计表Table1Theleveldesignofresponsesurfacemethodology因素水平-101-1A-液料比(mL·g)102030-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnB-提取温度(℃)455055C-提取时间(min)306090D-溶剂pH值234802.4均匀设计验证实验介于响应曲面实验在一定程度上解释了提取率与提取温度、提取时间、料液比和溶剂pH值四个自变量的关系，但由于提取物成分较多，保存时间差异大导致牛蒡叶提取物有效[24]成分发生改变的问题，适合进行提取物对木材腐朽菌的抑制能力抑菌实验；另外在牛蒡叶提取物提取率较高，不同提取物含有牛蒡叶内活性物质的含量和成分都将不同，即抑菌效85果可能存在差异。为了弥补响应曲面实验在此过程的缺陷，在响应曲面实验的基础上，以白腐菌为指示菌种，采用均匀设计表对牛蒡叶重新进行提取实验，验证响应曲面模型以及抑菌*4[25]效果。实验采用均匀设计U6(6)设计表作为实验设计参考，相关实验条件设计见表4。2.5抑制腐朽菌能力为了验证最终提取物在抑制木材腐朽菌的应用价值，确定其对白腐菌和褐腐菌的最低抑90菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)。将药剂两倍稀释7个梯度，分别为2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%，进行牛津杯法抑白腐菌、褐腐菌实验，判断各浓度下对两种菌的抑制能力。3结果与分析3.1预实验分析95表2中采用酸性水获得的10%浓度提取物平均抑菌效果最好，平均抑菌圈直径达到13.17mm，并且其提取率也是几中提取方式中最高，这或许是在此酸性条件下，溶剂的浓度[24]远大于细胞内的浓度，形成浓度差，在加热和搅拌等助溶条件作用下，促进了牛蒡叶细胞内活性成分的溶出和溶解。而酸性水提取物经乙醇萃取的部分抑菌能力次之（平均抑菌圈直径10.93mm），所以乙醇能够溶解牛蒡中的易溶于有机溶剂的抑菌活性成分，但溶于水中100的部分（萃取剩余部分）亦有抑菌效果，这可能二次浓缩过程中损失量较大以及不能溶解难[21,24]溶于有机溶剂的物质导致的。另外水提取物虽然是几种方式中抑菌圈直径最小，但其亦具有一定的抑菌效果，即水能够溶解牛蒡叶中的活性成分，可能是此条件下不能产生有效的浓度差，并且相对于有机溶剂的扩散渗透能力差，提取过程较慢，造成溶解的抑菌活性成分较少。从牛蒡叶提取率和抑菌效果考虑，酸性水溶液能够比乙醇溶剂获取更多类的抑菌物质，[20]105并且其抑菌效果最好；而且植物内部具有抑菌活性成分的含量是相对较低的，而采用水溶液能够在物质溶解度下溶解大部分目标物，同时溶解含量较高的、具有一定抑菌活性的水溶性成分等。所以采用酸性水溶液为提取溶剂，继续对其进行响应曲面优化实验。表2牛蒡叶预实验提取结果Table2Thepre-testresultsofburdockleafextract提取方式平均抑菌圈直径提取率(%)二次处理(mm)初提取-水提取30.748.70-酸性水33.0813.17-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn萃取剩余20.389.91酸性水乙醇萃取5.2110.93110注：“-”表示不进行二次处理；3.2单因素实验分析3.2.1液料比对提取的影响-1如图1所示，牛蒡提取率随着料液比的增加而增加，在提取率小于30mg·g的料液比-1时，提取率处于快速上升阶段；而当料液比大于30mg·g，总体趋于平缓。说明随料液比增115加，牛蒡叶中成分的不饱和量就越大，又有利于成分的浸出和溶解；但后期过多溶剂，虽有提取量的增加，但由于浓缩功耗（时间、能源等）的增加，造成成分的改变，并给浓缩增加-1了难度，降低提取效率。所以从功耗、效率考虑，选择10-30mg·g提取作为下一步实验指标较为合适。38363432(%)30提取率282624101520253035404550-1液料比（ml·g）120图1液固比对牛蒡叶提取率的影响Fig.1Theinfluenceofliquid-to-solidratioonextractingratioofburdock3.2.2温度对提取的影响如图2所示，在35-50℃时提取率缓慢增加，即加热能够增加分子运动速率，促进牛蒡叶成分的溶解；而50℃之后提取量显著减少，这可能是由于植物活性成分、活性蛋白等，125很多是含有脂键、不饱和键等易受温度影响的基团，因此为了减少温度对活性成分的影响，将温度范围控制在50℃左右，即在45-55℃的区间进行提取。38363432(%)30提取率2826243540455055温度（℃）图2提取温度对牛蒡叶提取的影响Fig.2Theinfluenceofextractingtemperatureonextractingratioofburdock1303.2.3时间对提取的影响-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn在提取时间对提取率的影响试验中(如图3)，30-60min提取率增加，但60min之后缓慢降低，说明随时间的增加，牛蒡叶内部某些成分在较长作用时间内，发生降解、挥发等反应，所以在30-90min范围内提取为宜。383634(%)3230提取率2826306090120150时间(min)135图3提取时间对牛蒡叶提取率的影响Fig.3Theinfluenceofextractingtimeonextractingratioofburdock3.2.4pH值对提取的影响在溶剂pH值对提取率的影响实验中(如图4)，提取率对pH值有很强的依赖性。在pH2条件下牛蒡叶的提取率明显高于其他pH值，而加入酸后的pH4溶液低于水（pH值为4.8）140的提取效果，说明加入乙酸后抑制了某些成分的溶出；但随着氢离子浓度的增加，细胞内外溶液的浓度差显著提高，提高了牛蒡叶提取率，即提取率在pH2-4范围内快速提高。因此在后续实验中，选择pH2-4进行后续优化实验。48464442(%)4038提取率363432302345pH图4pH对牛蒡叶提取率的影响145Fig.4TheinfluenceofpHonextractingratioofburdock3.3响应曲面分析3.3.1数据分析对获得的实验数据建立提取率与各因素提取回归模型，获得如表3分析数据。其中根据F值，知四个因素对牛蒡叶提取的影响程度为：pH值>料液比>温度>时间；另外模型150的p值<0.0001，拟合的模型整体较好，但其失拟项显著（p<0.0298），可能是非显著项的2增加或者AB等交互项的缺少造成的，因此采用逐步回归的方法进行分析，建立响应值提取率（y）和pH值（D）、料液比（A）、温度（B）、时间（C）的关系模型，如下：22y=-35.44-2.44A+3.85B+1.25C-21.27D+0.18AB+0.039AC-0.091AD-0.082BC-0.13A-0.024B+0.02056C2222222155+3.01D+0.0029AB-0.00029AC-0.0030AB-0.00020AC+0.00081BC(R=0.985)(1)-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn由于响应曲面不仅能减少实验量，而且可综合考虑各因素对响应值的影响，同时可借助[23]图形直观观察各因素间相互作用关系对响应值的影响程度。因此在绘制出响应曲面交互图（图5、图6、图7、图8），料液比与pH值间相互作用较强（图7）,其图像中的等高线较其他密集，即料液比的提高，增加了药粉与药剂充分接触，促进提取过程的进行；但各个因素160间的交互作用微弱，这也可从方差分析（表3）中看出，交互项p值不显著。表3响应曲面因子方差分析Table3AnovaforRSMquadraticmodelanalysis方差来源平方和Sum自由度均方MeanF值P值SourceofsquaresdfsquareF-valuep-value模型426.131430.4422.87<0.0001**ModelA23.35123.3517.540.0009**B3.5313.532.6560.126C0.2910.2920.220.647D306.621306.62230.41<0.0001**AB0.9810.980.730.406AC3.9413.942.960.107AD3.3313.332.500.136BC0.1810.180.130.721BD0.3110.310.230.638CD0.08510.0850.0640.8052A0.0005210.000520.000390.9852B5.3215.3202314.000.06532C13.74113.7410.320.0063**2D58.60158.6044.04<0.0001**残差Residual18.63141.33失拟项17.75101.778.020.0298*Lackoffit纯误差0.8940.22Pureerror总误差222444.7628R=0.958Radj=0.958Rpre=0.767Cortotal注：**表示极显著(p<0.01)，*表示显著(p<0.05)。165图5时间和液固比的交互作用分析Fig.5Theinteractionofthetimeandliquid-to-solid-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn170图6温度和液固比的交互作用分析Fig.6Theinteractionoftemperatureandliquid-to-solid图7液固比和pH的交互作用分析175Fig.7Theinteractionoftheliquid-to-solidandpH图8时间和温度的交互作用分析Fig.8Theinteractionofthetimeandtemperature3.3.2响应曲面验证分析-1180通过对提取回归模型的求解，获得牛蒡叶提取最佳条件为：料液比30.00mL·g、温度51.69℃、时间76.78min和pH2，此条件下理论提取率为45.81%。从实验可行性出发，对最佳-1条件进行修正为:料液比30mL·g、温度52℃、时间77min、pH2。在此修正条件下，三次实验的提取率均值为44.86%，与理论值相对差异率为-2.08%,差异性较小，其抑制指示菌-白腐菌的平均直径达到15.34mm，较预实验提高了16.47%，因此采用此条件对牛蒡抑菌物质进行185提取是合适的。3.4均匀设计验证通过料液比、时间、温度三因素的均匀设计提取实验，获得表4数据。另外由于试验次数仅为6组，因此不能进行二次项和交互项的分析，而且本次实验的水平间的间隔较小，所[23]以采用直观分析的方式进行分析，即抑菌效果最好的点所对应的条件离全面试验的最优190条件相差不会太远。其中1-4试验点为对模型进行的验证实验，5-6点为预测能力实验。表-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn4中各试验点实际值与响应面模型预测值平均差异为0.22%，即响应曲面模型解释性和预测性较好。表4均匀设计水平设计及结果Table4Levelandresultsofuniformdesign编号No123456-1A-液料比(mL·g)152025303540B-提取时间(min)6787107577797C-提取温度(℃)646056524844Y-提取率(%)41.8742.1542.1944.2545.6646.06与模型理论值差异(%)-6.78-0.113.173.16-0.65-0.08Z-平均抑菌效果(mm)9.2811.0212.0113.9815.6113.581955号试验点与响应曲面给出的最优提取条件差异不大，其10%提取物对白腐菌的抑菌圈直径为15.61mm，并且在抑菌直径上较预实验酸性水提高了18.53%，与响应曲面最优提取方式下提取物的抑菌效果差异不显著(p=0.284)，两种提取物抑菌直径差异仅为1.26%，即在高于响应面优化条件下获得的活性物质含量变化不明显。另外虽然响应曲面得出的结果部分-1条件达到边界值（ph=2以及料液比30ml·g），但实际过程中随着液料比的增加，后期浓200缩过程所需要的能源、时间等也会增加，这也是单因素实验范围选择所考虑的结果。所以直接采用响应曲面优化结果作为下一步研究的实验条件较为合适。3.5提取物抑制腐朽菌效果如表5，牛蒡提取物对白腐菌和褐腐菌具有良好的抑菌性能，在14%左右达到最高抑制能力。另外在一定浓度范围内，两者抑菌能力随着浓度的增加而变强，在2%时无明显抑菌205圈，所以其对两种菌的最低抑菌浓度应在2%-4%浓度范围内。介于牛津杯法中浓度的对数与抑菌圈直径的平方成线性关系，所以在抑菌直径单调范围内获得抑菌效果方程，即：2222DCv=331.86LogC+572.47(R=0.957)，DGt=266.91LogC+436.82(R=0.861)，（式中：DCv，DGt分别白腐菌和褐腐菌抑菌圈直径，C为药液浓度），因此白腐菌和褐腐菌的最低抑菌浓度(即最低抑菌浓度下的抑菌圈直径等于牛津杯内径6mm时的浓度)分别为2.42%、3.15%，210即此种提取物对白腐菌的敏感性高。而其他文献中对印楝种子粉末进行提取，获得对白腐菌[26]和褐腐菌的最低抑菌浓度为2%和5%的效果，以及银杏心材提取物最低抑菌浓度分别为[27]6%和2%，说明本方法获得的提取物对两种菌具有良好的抑菌效果，广谱性较好。表5梯度抑菌实验Table5Concentrationgradientanti-fungalexperiment菌种药液浓度(%)246810121416C.v(mm)-10.7212.7314.4815.4015.6717.6416.06G.t(mm)-9.269.9611.1512.3313.6515.5213.86215注：“-”表示无明显抑菌效果。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn4结论本实验中根据牛蒡叶提取实验获得的提取物抑菌效果，认为：（1）酸性条件下，牛蒡叶细胞内外产生浓度差，在扩散作用和渗透压作用下，细胞内促进了细胞内容物的溶解到水溶液中，造成提取物的抑菌能力高于有机相。220（2）经单因素和响应曲面数据分析得出各自变量对提取效果的影响程度不同，其中pH值>料液比>温度>时间,确定的提取最佳工艺条件为：30.00mL·g-1、温度52℃、时间77min和pH2，平均提取率为45.66%，提取物的抑菌效果达到15.34mm，较提取预实验结果提高了16.48%。（3）最终获得提取物对白腐菌和褐腐菌的最低抑菌浓度达到2.42%、3.15%，均具有良好的[26-27]225抑制能力，对白腐菌的敏感性更强，并且比其他植物源提取物拥有较好的对木腐菌抑制能力。（4）采用均匀设计与响应曲面相结合的方式，能够使得两者相互印证，减少实际实验中不足，促进实验进程的进行。（5）本实验中提取物中果胶、蛋白质等杂质较多，还需对提取物进行后期处理，以提高牛230蒡叶提取物抑菌活性成分含量。[参考文献](References)[1]SmithAL,CampbellCL,WalkerDB,etal.Extractsfromblacklocustaswoodpreservatives:extractionofdecayresistancefromblacklocustheartwood.[J].Holzforschung,1989,43(5):293-296.[2]TasciogluC,YalcinM,SenS,etal.Antifungalpropertiesofsomeplantextractsusedaswoodpreservatives[J].235InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2013,85(11):23-28.[3]刘泽旭，徐国祺，王立海.樟树叶提取物及其复配剂对竹材的防霉抑菌效果[J].林业科技开发，2015，06:104-108.[4]刘泽旭，徐国祺，王立海.乙醇水溶液提取樟树叶活性成分工艺及其成分分析[J].东北林业大学学报，2016，07:34-39.240[5]MondallNK,MojumdarA,ChatterjeSK,etal.Antifungalactivitiesandchemicalcharacterizationofneemleafextractsonthegrowthofsomeselectedfungalspeciesinvitroculturemedium.[J].JournalofAppliedSciences&EnvironmentalManagement,2009(1).[6]邸向辉.以印楝提取物为基质的木材防腐剂微囊制备及性能研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2014.[7]娄在祥.牛蒡功能性成分及其抗氧化、抗菌活性研究[D].无锡：江南大学，2010.245[8]娄在祥，王洪新，陈尚卫等.牛蒡叶多酚的超声波辅助提取及抗氧化活性、成分分析研究[J].食品工业科技，2010，31(8):261-264.[9]OhnishiM,MorishitaH,IwahashiH,etal.Inhibitoryeffectsofchlorogenicacidsonlinoleicacidperoxidationandhaemolysis[J].Phytochemistry,1994,36(3):579-583.[10]吴昊.超声波-微波协同萃取金银花与绿原酸的工艺研究[J].化学工程与装备，2015，12:45-49.250[11]李淼，王永香，孟谨，付小环，毕宇安，王振中，萧伟.HPLC法测定金银花中新绿原酸等8种成分的量[J].中草药，2014，07:1006-1010.[12]卢琪，段家彩，高丽，陈若雯，傅虹飞，潘思轶.杜仲绿原酸的分离纯化及结构鉴定[J].食品科学，2010，14:275-279.[13]熊硕，崔丽，刘仲华，张盛，肖文军.正交试验优化大孔吸附树脂分离纯化杜仲绿原酸[J].食品科学，2552013，16:23-26.[14]CliffordMN,KaziT.Theinfluenceofcoffeebeanmaturityonthecontentofchlorogenicacids,caffeineandtrigonelline[J].FoodChemistry,1987,26(1):59-69.[15]MoonJK,YooHS,ShibamotoT.Roleofroastingconditionsinthelevelofchlorogenicacidcontentincoffeebeans:correlationwithcoffeeacidity.[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry,2009,57(57):5365-9.260[16]袁俊，阮鸣，陈静，周益倩.咖啡中绿原酸高效液相色谱法测定及不同提取工艺的比较研究[J].南京师大学报(自然科学版)，2014，04:94-98.[17]范金波，蔡茜彤，冯叙桥，李萌萌，段小明，梁洁玉.绿咖啡豆提取物的抗氧化性研究[J].食品工业科技，2014，09:72-77.[18]陈世雄，陈靠山.牛蒡根化学成分及活性研究进展[J].食品与药品，2010，07:281-285.265[19]林学政，柳春燕，何培青等.牛蒡叶内绿原酸抑制植物病原真菌的研究[J].植物保护，2005，31(3):35-38.[20]刘世名，董国霞，陈靠山.牛蒡叶中绿原酸的提取工艺优化[J].中国药学杂志，2003，09:21-23.[21]商鸿生.植物免疫学[M].北京：中国农业出版社，2010.-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn[22]刘丹赤.牛蒡叶中绿原酸的提取纯化工艺研究[D].济南：山东师范大学，2007.[23]何为，唐斌，薛卫东.优化试验设计方法及数据分析[M].北京：化学工业出版社，2012.270[24]宋晓凯.天然药物化学[M].北京：化学工业出版社，2004.[25]方开泰.均匀设计与均匀设计表[M].北京：科学出版社，1994.[26]邸向辉.以印楝提取物为基质的木材防腐剂微囊制备及性能研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2014.[27]张玲.银杏树木提取物对木材防腐作用的研究[D].南京：南京林业大学，2009.-10-'