玉米大斑病菌StPP2A-C基因的克隆及原核表达.pdf 7页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn玉米大斑病菌StPP2A-C基因的克隆及原核#表达**于波，赵玉兰，李盼，郝志敏5（河北农业大学生命科学学院河北省保定市071000）摘要：【目的】克隆玉米大斑病菌（Setosphaeriaturcica）2A型蛋白磷酸酶催化亚基基因（StPP2A-C）的cDNA全长，并构建其原核表达载体，在大肠杆菌中诱导融合表达并对目的蛋白进行初步纯化，为进一步研究其功能奠定基础。【方法】利用StPP2A-C的特异引物10从玉米大斑病菌cDNA中扩增该基因cDNA全长，测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pGEX-4T-1中，转化大肠杆菌BL21并诱导表达，然后利用亲和层析的方法对目的蛋白进行纯化。【结果】获得了954bp的StPP2A-C基因cDNA全长；将其在大肠杆菌中进行原核表达，获得了60kD的融合蛋白，大小符合预期。30℃1mmol•L-1IPTG诱导4h后，可获得较多可溶态表达产物，用亲和层析方法纯化后，能够获得单一的目的蛋白。【结15论】从玉米大斑病菌cDNA中扩增得到StPP2A-C基因cDNA全长，成功构建了其原核表达载体，并在大肠杆菌中能高效表达，初步得到了纯化的目的蛋白。关键词：玉米大斑病菌；2A型蛋白磷酸酶；原核表达；蛋白纯化中图分类号：Q945.820CloningandProkaryoticExpressionofStPP2A-CfromSetosphaeriaturcicaYUBo,ZHAOYulan,LIPan,HAOZhimin(CollegeofLifeSciences,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding,Hebei071000,China)Abstract:【Objective】Inordertolaythefoundationforfurtherstudyofthedownstream25phosphorylationtargetsof2Atypeproteinphosphotase(PP2A)inSetosphaeriaturcica,thewholecDNAofStPP2A-C,thegeneencodingthecatalyticsubunitofPP2AinS.turcica,wasclonedandexpressedinEscherichiacoli.【Method】ThewholecDNAofStPP2A-CgenewasamplifiedfromthecDNAofS.turcicawiththespecificprimersofStPP2A-C,andthegenefragmentswereconnectedtotheprokaryoticexpressionvectorpGEX-4T-1,whichwastransformedintoE.coliBL21andinduced30toexpressthefusionprotein.Thenthemethodofaffinitychromatographywasexployedtopurifythetargetprotein.【Result】ThewholecDNAofStPP2A-Cgenewas954bpandencodedaproteinwiththecalculatedmolecularweightof60kD.ResultsofSDS-PAGEshowedthatthespecificfusionproteinwassuccessfullyinducedtoexpressbyIPTG.Inducedby1mmol•L-1IPTGat30℃,thetransformantscouldexpressmoresolubleproductsthanthatinducedby1mmol•L-1IPTGat37℃.35Afteraffinitychromatographypurified,asingletargetproteinwasobtained.【Conclusion】Inthisstudy,thefulllengthcDNAofStPP2A-CgenewasobtainedfromSetosphaeriaturcica,andtheprokaryoticexpressionvectorforthisgenewasconstructed,andthenwassuccessfullyinducedtoexpressbyIPTGinBL21.Keywords:Setosphaeriaturcica;PP2A;Prokaryoticexpression;Proteinpurification40基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（新教师类）（20131302120008）作者简介：于波（1990.04-）男，微生物与生化药学通信联系人：郝志敏（1979.03-），副教授，微生物与生化药学.E-mail:hzm_0322@163.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn0引言玉米大斑病（Northerncornleafblight）是严重威胁玉米生产安全的重要真菌性病害之一[1]。自2002年以来，我国春玉米种植区大斑病发生日趋严重，尤其2012~2016年间，在东45北及西北地区相继大面积发生，给玉米生产造成了惨重的损失。迄今为止，该病害的防治仍主要依赖抗病品种以及近年来国家玉米产业技术体系推广的病害前移药剂防治技术。其病原为大斑刚毛座腔菌（Setosphaeriaturcica(Luttrell)Leonard&Suggs），俗称玉米大斑刚毛座腔菌大斑病菌，对于玉米大斑病菌的防治由于现有药剂持效期短，内吸性差，导致难于达到理想防效对利用抗病育种防治玉米大斑病带来巨大挑战。502A型蛋白磷酸酶（proteinphosphatase2A，PP2A）是一种重要的磷酸酶之一，属磷酸化丝/苏氨酸残基蛋白磷酸酶（phosphoserineandphosphothreonineresiduesphosphatases，PPP）家族，由PP2A-C（catalyticsubunit）和PP2A-B（regulatorysubunit）和PP2A-A（Structuralsubunit）组成，哺乳动物细胞中的PP2A调节亚基有4种形式，分别命名为B、B＇、B＇＇、[2]B＇＇＇。而真菌基因组中，则普遍存在B和B＇两种调节亚基，如酿酒酵母（Saccharomyces[3,4][5][6]55cerevisiae）、拟轮生镰孢、构巢曲霉等。PP2A参与调节细胞周期、细胞代谢、信号转导等多种生物学活性，并且与肿瘤、癌症等多种疾病的发生相关。因此，以PP2A为线索，揭示其作用的分子机制，将为揭示病菌发育及致病性的调控机制，发掘新型药靶奠定坚实基础。1材料与方法601.1试验材料1.1.1菌株和质粒玉米大斑病菌野生型菌株01-23，原核表达载体pGEX-4T-1由河北农业大学生命科学学院真菌毒素与植物分子病理学实验室保存；大肠杆菌DH5α和BL21从北京全式金公司购买。1.1.2主要试剂65PCR反应所用试剂、DNA凝胶回收试剂盒、BamHI和XhoI限制性内切酶、T4DNA连接酶、反转录试剂盒、均为大连TaKaRa公司产品；常用化学试剂均为国产化学纯；引物由上海生工合成；测序由华大基因测序完成。1.2方法1.2.1总RNA的提取和单链cDNA的合成70采用Trizol法提取总RNA。cDNA合成参照TaKaRa公司的TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0使用说明书进行。1.2.2StPP2A-C基因cDNA全长序列的克隆利用DNAMAN软件对StPP2A-C基因序列进行酶切位点分析，通过Primer5.0设计引物PP2A-CY-F/R:5’-3’CCCGGGATGCCCGGTCTACCGTC/GAATTCTCAGAGGAAGTA-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn75CTCCGTCGTC。以提取的玉米大斑病菌野生型菌株cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。PCR程序为95℃(10min)；94℃(30s)，58℃(30s)，72℃(1.5min)，32个循环；72℃(10min)。扩增产物根据Sanprep柱式gelpurificationkit说明对目的产物进行胶回收并纯化。1.2.3原核表达载体的构建回收目的片段与pMD-19载体16℃连接，转化大肠杆菌感受态DH5a，将转化后的菌液80均匀涂布在加入氨苄的LB培养基上，待长出单菌落后挑取单菌落于LB液体培养基中培养，然后用通用引物M13-F/R进行菌液PCR验证阳性克隆，将阳性克隆送测序，测序正确的阳性克隆用质粒提取试剂盒提取质粒pMD-19-StPP2A-C，将pMD-19-StPP2A-C与表达质粒pGEX-4T-1同时用BamHI和XhoI进行双酶切5h，酶切后用琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，用胶回收试剂盒回收回收目的片段StPP2A-C与pGEX-4T-1，在T4连接酶作用下将StPP2A-C85连接到pGEX-4T-1载体上，16℃连接过夜。将连接产物转化DH5a感受态细胞，在氨苄抗性的LB平板上挑取重组质粒，通过PCR筛选阳性克隆、并利用双酶切对阳性克隆进行验证。构建成功的表达质粒命名为pGEX-4T-1-StPP2A-C，将验证正确的质粒转化BL21感受态细胞。1.2.4重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达及SDS-PAGE分析90挑取单克隆至加有抗性的1mLLB液体培养基中培养1h，进行菌液PCR检测，条带正-1确的转接到30mLLB（100μg·mLAmp）中过夜培养，次日吸出800μL至新的30mLLB培养基中振荡培养至OD600为0.5-0.6时，加入IPTG进行诱导表达。IPTG终浓度为-11mmol·L时在30℃诱导4h后收集菌液，4℃保存备用。未加IPTG诱导的pGEX-4T-1-StPP2A-C收集作为阴性对照。诱导全部完成后，各取5mL菌液离心收集菌体，95加入SDS上样缓冲液，悬浮混匀，沸水浴10min，10000rpm离心1min，取上清4℃保存备用。另取5mL菌液离心收集菌体后用1×PBS将沉淀悬起，经超声破碎细胞（20mm的变幅杆，400W，超声2s，间隔5s，重复60次），10000rpm离心1min分离上清和沉淀。上清和沉淀样品中分别加入SDS上样缓冲液，混匀，沸水浴，上清和沉淀分别进行SDS-PAGE（5%浓缩胶，12%分离胶），然后分析蛋白表达结果。1001.2.5StPP2A-C蛋白的纯化经IPTG诱导培养的菌液，细胞破碎后，在裂解液中加入TritonX-100，终浓度为1%，冰上放置30min，最高转速，4℃离心20min，上清转移到新的1.5mLEP中，最高转速离心4℃20min；取上清4℃保存；在蛋白裂解液中加入200μL的Beads，置于静音混合仪上，在4℃下混合1h；取出混匀的蛋白，500g/min转速条件下离心，时间为1min；用1×Washing105buffer每次1mL洗沉淀Beads，共5次；洗完后放于4℃保存。进行SDS-PAGE胶分析，查看结果。2结果2.1玉米大斑病菌PP2A-C基因克隆-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn分析玉米大斑病菌PP2A-C基因序列，分别设计带有BamHI、XhoI酶切位点命名为110PP2A-C-YF和PP2A-C-YR的引物，以玉米大斑病菌野生型菌株cDNA当做为扩增的模板来进行的PCR的扩增，获得一条约954bp的目的条带（图1）。然后对需要的片段进行回收纯化，与pMD-19载体连接并转化。获得的阳性克隆送测序，测序结果比对，结果与预期的StPP2A-C基因cDNA序列一致，说明扩增得到了正确的目的片段。115图1StPP2A-C基因的PCR扩增Fig.1PCRamplificationofStPP2A-cgeneM:DNAMarker(100-2000bp)2.2原核表达载体的构建及鉴定对测序正确的阳性克隆用两种酶来酶切，并连接到相同酶切回收后的pGEX-4T-1120（BamHI、XhoI）载体上。获得pGEX-4T-1-StPP2A--C原核表达载体，转化大肠杆菌DH5α。对重组的质粒被提取后进行了PCR验证及酶切验证，均能获得目标条带（图2A、2B），与预期大小一致，表明pGEX-4T-1-StPP2A-C原核表达的重组载体已然构建成功。图2原核表达载体双酶切及PCR验证Fig.2IdentificationofexpressionvectorbyPCRandrestrictionenzymedigestion125A:M:DNAMarker(100-5000bp)B:M:DNAMarker(100-2000bp)2.3原核表达产物的检测重组质粒pGEX-4T-1-StPP2A-C转化BL21成功后，获得阳性克隆，然后用诱导剂诱导-1其表达，SDS-PAGE检测。首先在终浓度为2mmol•LIPTG，37℃条件下诱导3h，发现含-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnpGEX-4T-1-StPP2A-C的菌株诱导后会在60kD左右有相应条带（图3-A），与目的条带大130小相符，但37℃这样的条件下诱导后，表达后蛋白多在包涵体中存在，可溶性蛋白较少不利于纯化。为了能够获得更多的可溶性表达的StPP2A-C-GST融合蛋白，在IPTG终浓度是-11mmol•L在30℃这样的条件下诱导4h。结果表明，在不同温度和不同的IPTG的终浓度下，StPP2A-C-GST融合蛋白都均能被诱导。但在37℃条件下可溶性蛋白较少，而在30℃-1和IPTG终浓度1mmol•L浓条件下诱导的融合蛋白的可溶性蛋白较多（图3-B）。135140145图3StPP2A-C蛋白表达的检测Fig.3DetectionofStPP2A-CproteinexpressedinE.coliA：蛋白诱导表达的验证（1：诱导前2：加IPTG诱导后）B：30℃下诱导与可溶性蛋白检测（1：诱导前2：IPTG诱导后3：可溶性蛋白4：包涵体蛋白）1502.4目的蛋白的纯化-1为了纯化更方便，选择在30℃和IPTG的最终的浓度是1mmol•L的这样的条件下诱导StPP2A-C的原核表达，收集菌体用超声法进行破碎，收集破碎后上清液进行洗脱纯化蛋155白。结果显示，纯化后能得到目的条带，但是必须进行多次洗脱（5次以上），否则会留下杂带（图4）。160165图4StPP2A-C蛋白纯化Fig.4ThepurificationofStPP2A-CproteinA/C:IPTG诱导后蛋白表达B：纯化后目的蛋白（洗脱5次以下）D：纯化后目的蛋白（洗脱5次以上）-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn3讨论170PP2A是广泛参与真核细胞信号转导的多功能蛋白磷酸酶，通过作用于众多转录因子和[7,8]蛋白激酶，在真核生物细胞周期调控、形态建成、发育及疾病发生过程中发挥重要作用[9,10][11,12]，并因此已成为治疗肿瘤、阿茨海默症、糖尿病等重大疾病的靶标。在真菌中，PP2A2+通过与cAMP、Ca、MAPK、TOR、SIN等多条信号途径的交叉互作，参与真菌的细胞形态建成、自噬、次生代谢等过程，其对病原真菌致病性的调控作用也已在灰葡萄孢（Botrytis175cinerea）、稻梨孢（Magnaportheoryzae）、构巢曲霉（Aspergillusnidulans）、拟轮生镰孢（Fusariumverticillioides）等病原真菌中得到充分证实。PP2A在各真核生物中高度保守，而且具有很强的自我调节能力，所以表达会维持在相对稳定水平，这种表达自我调节的现象[13]主要发生在转录后水平，很少与转录水平的改变有关系。但是，在一些报道也表明，PP2A亚基的调节会在转录水平发生，比如在HL-60细胞的全反式维甲酸诱导分化中会出现这样[14,15]180的现象。PP2A在玉米大斑病菌中的作用机制尚不明确，本试验通过对StPP2A-C的原核表达以及产物纯化，为研究其互作蛋白以及进一步明确其作用的分子机制奠定了基础。大肠杆菌表达系统具有对目的基因的表达水平高和生长快速周期短等特点，所以现在应用最为广泛。但是，蛋白的表达受到多种因素的影响，包括温度、时间以及诱导剂的浓度等等。当然，最主要的还是目的基因本身的影响。本试验用了pGEX-4T-1载体，该载体具有TAC185启动子，可以是目的蛋白高效表达。另外，本试验对诱导温度以及诱导剂浓度进行了摸索，-1确定了该基因诱导表达的最佳温度及浓度。发现在30℃和IPTG的最终的浓度是1mmol•L的这样的条件下诱导，PP2A-C溶解蛋白最多，为大量的蛋白纯化提供基础。4结论本研究获得了玉米大斑病菌StPP2A-C基因cDNA全长，成功构建了其原核表达载体，190并在大肠杆菌中高效表达，初步得到了纯化的目的蛋白。[参考文献](References)[1]DongJG,FanYS,GuiXM,etal.GeographicdistributionandgeneticanalysisofphysiologicalracesofSetosphaeriaturcicainNorthernChina[J].AmericanJournalofAgriculturalandBiologicalSciences,2008,3(1):195389-398.[2]ParthasarathyS,PoomyP,KaustubhD,etal.Phosphatase:PP2Astructuralimportance,regulationanditsaberrantexpressionincancer[J].CancerLetters,2013,335:9-18.[3]ValentinaR,SatoshiY.SpatialregulationofCdc55-PP2AbyZds1/Zds2controlsmitoticentryandmitoticexitinbuddingyeast[J].JournalofCellBiology,2011,193(3):445-454.200[4]JessicaZ,NoahD,MacDonoughT,etal.PP2ARts1isamasterregulatorofpathwaysthatcontrolcellsize[J].JournalofCellBiology,2014,204(3):359-376.[5]ShinJH,KimJ,Malapi-wightM,etal.Proteinphosphatase2AregulatorysubunitsperformdistinctfunctionalrolesinthemaizepathogenFusariumverticillioides[J].MolecularPlantPathology,2013,14(5):518-529.[6]ZhongGW,JiangP,QiaoWR,etal.Proteinphosphatase2A(PP2A)regulatorysubunitsParAandPabA205orchestrateseptationandconidiationandareessentialforPP2AactivityinAspergillusnidulans[J].EukaryoticCell,2014,13(12):1494-1506.[7]HeinAL,SeshacharyuluP,RachaganiS,etal.PR55subunitofproteinphosphatase2Asupportsthetumorigenicandmetastaticpotentialofpancreaticcancercellsbysustaininghyperactiveoncogenicsignaling[J].CancerResearch,2016,76(8):2243.210[8]HuangBF,YangCS,WojtonJ,etal.MetaboliccontrolofCa2+/Calmodulin-dependentproteinkinaseII(CaMKII)-mediatedcaspase-2suppressionbytheB55/proteinphosphatase2A(PP2A)[J].JournalofBiological-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnChemistry,2014,289(52):35882-35890.[9]OhanianC.Histochemicalstudiesonphosphorylaseactivityinthetissuesofthealbinoratundernormalandexperimentalconditions[J].ActaAnat-omica,2014,35(4):142-148.215[10]SutterB,WuX,LaxmanS,etal.MethionineinhibitsautophagyandpromotesgrowthbyinducingtheSAM-responsivemethylationofPP2A[J].Cell,2013,154(2):403-15.[11]YangB,RisaK,ParmilKB,etal.SyntheticgeneticarrayscreenidentifiesPP2AasatherapeutictargetinMad2-overexpressingtumors[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2014,111(4):1628-1633.220[12]ElenaA,RaffaellaP,OderoMD.Proteinphosphatase2Aasatherapeutictargetinacutemyeloidleukemia[J].FrontiersinOncology,2016,6(1):78.[13]BahariansZ,SchönthalAH.Autoregulationofproteinphosphatasetype2Aexpression[J].JournalofBiologicalChemistry,1998,273(30):19019.[14]TawaraI,NishikawaM,MoritaK,etal.Down-regulationbyretinoicacidofthecatalyticsubunitofprotein225phosphatasetype2AduringgranulocyticdifferentiationofHL-60cells.[J].FebsLetters,1993,321(2-3):224-228.[15]NishikawaM,OmaySB,ToyodaH,etal.Expressionofthecatalyticandregulatorysubunitsofproteinphosphatasetype2Amaybedifferentiallymodulatedduringretinoicacid-inducedgranulocyticdifferentiationofHL-60cells[J].CancerResearch,1994,54(18):4879.-7-'