肉桂酸小檗红碱酯的合成及抗炎活性.pdf 8页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn#肉桂酸小檗红碱酯的合成及抗炎活性1111112**贺芬，刘艳飞，张姗姗，张晓红，李宜褰，谢雄，刘珍宝（1.中南大学化学化工学院，长沙410083；52.中南大学湘雅药学院，长沙410013）摘要：以小檗碱和肉桂酸为原料，通过去甲基化、乙酰化、成酯反应合成小檗碱衍生物肉桂酸小檗红碱酯，采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型，观察致炎后肉桂酸小檗红碱酯对小鼠耳肿胀程度及血清中炎症因子TNF-α、IL-6的影响，考察其抗炎活性。红外光谱、核磁共振氢谱碳10谱以及质谱确认了产物化学结构；小鼠耳肿胀结果显示合成的目标产物肉桂酸小檗红碱酯能降低耳肿胀及抑制TNF-α、IL-6水平的升高，且呈剂量依赖性，说明其具有抗炎活性。关键词：小檗碱；肉桂酸小檗红碱酯；药物合成；抗炎活性中图分类号：O615Synthesisandanti-inflammatoryactivityof9-O-cinnamicberberine11111HEFen,LIUYanfei,ZHANGShanshan,ZHANGXiaohong,LIYiqian,XIE12Xiong,LIUZhenbao(1.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,CentralSouthUniversity,Changsha410083;202.XiangyaSchoolofPharmaceuticalSciences,CentralSouthUniversity,Changsha410013)Abstract:9-O-cinnamicberberinewassynthesizedfromberberineandcinnamicacidviademethylation,acetylationandesterificationtionanditsanti-inflammatoryactivitywasevaluatedviathexylene-inducedearoedemamicemodel.TheearswellingextentandtherelatedinflammatoryfactorssuchasTNF-α,IL-6inserumwereobserved.Thestructureofthetargetcompoundwasconfirmedby25IR,1H-NMR,13C-NMR,andmassspectrum.ThetargetcompoundhasloweredtheearswellingextentandinhibitedtheserumleversofTNF-α,IL-6inadosedependentmanner,whichindicatingthiscompoundhasanti-inflammatoryeffects.Keywords:Berberine;9-O-cinnamicberberine;pharmaceuticalsynthesis;anti-inflammatoryactivity0引言30小檗碱（berberine），又称黄连素，对革兰氏阳性、阴性菌具有抑制作用。近年来研究证实，小檗碱具有多种药理活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、降血糖等，故临床应用较多，可应用于治疗细菌性感染、腹泻、心律失常、高血压、糖尿病、高血脂等疾病。随着研究的深入，小檗碱在降糖调脂、抑菌、抗胆碱酯酶和抗炎活性方面的作用机制也进一步[1]明确。以小檗碱为基础进行的结构修饰以改变其药理活性成为当前研究的热点。目前其结[2]35构修饰主要集中在小檗碱的C2、3、4、8、9、10、11、12、13位。Iwasa等合成了一系列小檗碱类化合物，并研究了其结构与抗菌活性的关系，发现处于芳环C中的季铵结构及2、3位上亚甲基，8、9、13位上烷基链长度，12位的卤素取代均可影响小檗碱类化合物的抗[3]菌活性。随后，Hong等研究发现9位氧接入酰基和苯酰基后，随着烷基链长度的增长，其抗菌活性逐渐增强，说明9位取代亲脂性的增强有助于该类化合物抗菌活性的增强。Park[4]40等发现13位接入叔丁基及苯基后，抗真菌活性均强于小檗碱及相应的小檗红碱衍生物。基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金-新教师类（20130162120078）；国家自然科学基金青年基金（81301258）；湖南省自然科学基金（2016JJ2161）；中南大学升华育英计划研究基金；张姗姗的研究生创新项目作者简介：贺芬（1995-），女，硕士，主要研究方向：药物递送系统研究通信联系人：刘珍宝（1983-），男，副教授，主要研究方向：分子药剂学.E-mail:zhenbaoliu@csu.edu.cn-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn炎症是宿主的防御机制，由多种因子参与，表现为热、痛、红、肿等功能障碍。近年来，[5]国内外对小檗碱及其衍生物的抗炎活性进行了一定的研究。舒德忠等对溃疡性结肠炎小鼠模型进行试验发现小檗碱能有效缓解小鼠的结肠粘膜受损情况和临床症状，并呈一定的剂量[6]依赖性。杜丽蕊等通过研究小檗碱对二硝基氟苯诱导的小鼠迟发型超敏反应的实验结果证45明小檗碱具有明显的抗炎作用，其可能机制为小檗碱降低了小鼠T细胞与细胞外基质的黏[7][8]附能力。JuanLu等指出小檗碱能显著降低炎症反应中一氧化氮的释放。李宇馨等发现小檗碱可明显降低由甲醛引起的小鼠足肿胀组织中的前列腺素含量，推测其抗炎机制可能与抑[9]制组织中的前列腺素生成有关。HyunWooJeong等研究了小檗碱对脂多糖诱导的RAW264.7细胞和腹膜巨噬细胞的影响，指出其能抑制细胞中炎症因子环氧合酶-2、单核细50胞趋化蛋白、单核细胞趋化蛋白、白细胞介素（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）的表达。In-Ah[10][11]Lee等发现小檗碱主要通过影响NF-κB途径抑制脂多糖诱导的炎症。Dong-UngLee等研究了13-乙基小檗碱和13-甲基小檗碱对脂多糖诱导的细胞中炎症介质的影响，证明其能很好的抑制白细胞介素（IL-12）。肉桂酸又名桂皮酸，是一种苯环上联有丙烯酸基团的化合物，广泛存在于自然界之中，55具有多种生理活性，如：治疗动脉粥样化，抗过敏，消炎杀菌，抗氧化，抗癌，抗血栓形成和保护心脏等功能。肉桂酸类衍生物也因其具有抗氧化，抗炎，抗过敏，抗血栓，抗癌等生理活性而广泛应用于医学领域。本研究以小檗碱和肉桂酸为原料，合成肉桂酸小檗红碱，通过红外光谱、核磁共振氢谱碳谱以及质谱确认其产物化学结构并考察其抗炎活性。601仪器与试剂核磁共振谱使用INOVA-500型超导傅立叶变换核磁共振谱仪（美国Varan公司，TMS为内标，DMSO-D6为溶剂）测定；红外光谱使用AVATAR370型红外光谱仪（美国Waters公司）测定；质谱使用VGZAB-HS型质谱仪（英国）测定；DNM-9606型酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)、电子分析天平（舜宇恒平仪器）、高速离心机（长沙湘智离心机65仪器公司）、小鼠TNF-α、IL-6ELISA试剂盒（上海诺渊实业有限公司）、小鼠60只，雌雄各半，体重18-22g（长沙斯莱克景达实验动物技术有限公司）。二甲苯(东莞市力冠化工有限公司），羧甲基纤维素钠(山东阳谷江北化工），小檗碱（郑州荔诺生物科技有限公司），肉桂酸（武汉贝尔卡生物有限公司），其余试剂皆为市售的化学纯或分析纯。2实验702.1化合物的合成以小檗碱和肉桂酸为原料合成肉桂酸小檗红碱酯的反应路线如图1所示。-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn5图1肉桂酸小檗红碱酯的合成路线75Fig.1Synthesisof9-O-cinnamicberberine2.2化合物2的合成[12]0按参考文献所述实验方法合成目标产物小檗红碱（化合物2）。称取20.0g（0.054mol）小檗碱，真空下加热至190℃反应0.5h，冷却至室温，所得固体用甲醇重结晶，抽滤，干燥滤饼，得小檗红碱（化合物2）。802.3化合物4的合成在100mL圆底烧瓶中，加入3.6g（24.3mmol）肉桂酸，在低温釜中冷却到0℃以下，滴加5滴吡啶，搅拌下缓慢滴加2.5mL（34.5mmol）氯化亚砜（SOCl2），转入油浴缓慢升温至60℃，搅拌回流反应2h，薄层色谱检测反应进程。反应完毕后，冷却至室温，减压蒸发除去多余的氯化亚砜，得到浓稠淡黄色油状液体即为肉桂酰氯（化合物4），加入二氯甲850烷10mL待用。2.4化合物5的合成称取1.55g（4.3mmol）小檗红碱溶解于40mL二氯甲烷中，加入2mL三乙胺作缚酸剂，于0℃下用滴液漏斗滴加稀释的肉桂酰氯溶液，滴加完毕后常温搅拌反应4h，抽滤，5滤饼置于真空干燥箱60℃烘干8h。得金黄色粉末状固体即9-O-肉桂酸小檗红碱酯（化合90物5）。为进一步考查了小檗红碱和肉桂酸的投料比对产率的影响，在相同的条件下，分别采用不同投料比进行反应。采用n(肉桂酸):n(小檗红碱)摩尔比分别为4.5:1，5:1，5.5:1，6:1时，考察化合物5的收率。3抗炎活性研究53.1小鼠耳肿胀试验95将60只小鼠按性别体重随机分为6组，分别为空白对照组，小檗碱组，肉桂酸组-1-1（0.1560g·kg），肉桂酸小檗红碱酯化合物5高、中、低剂量组（0.8265，0.4133，0.2066g·kg），5每组10只，雌雄各半。所有实验用的药物均用0.5%羧甲基纤维素钠配成相应浓度，经口灌胃给药，给药体积20mL/kg，每日给药1次，连续7天。低、中、高剂量比为1：2：4，空白组给0.5%羧甲基纤维素钠。各组均于末次给药后1h，将小鼠右侧耳廓正反面均匀涂100抹二甲苯20μL，左耳作为正常对照。致炎1h后从小鼠眼眶采血，用7mm直径的打孔器在小鼠两片耳廓的同一位置制备小鼠圆耳片，用精密电子分析天平称重，以左右耳片重量0（mg）差值表示炎性肿胀程度。肿胀度抑制率计算公式如下：-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn肿胀抑制率(％)=（空白对照组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/空白对照组平均肿胀度×100％1053.2小鼠血清中炎症因子水平测定采用ELISA试剂盒测量小鼠血清中的TNF-α、IL-6水平，操作步骤严格按照试剂盒中说明书所示方法进行，使用SPSS17.0统计学软件处理本实验获得的全部数据。4结果及讨论1104.1化合物的合成化合物2为暗红色固体。合成化合物4时氯化亚砜用量一般是过量的，实验后处理中必须蒸除多余的氯化亚砜，由于氯化亚砜很容易水解产生腐蚀性的SO2和HCl气体，会腐蚀实验设备，未除净的氯化亚砜对后续反应也会产生影响。为此本实验中减少SOCl2的用量，使n(SOCl2):n(肉桂酸)=1.08:1左右，这样可降低实验后处理的难度，保持产品纯度，避免115腐蚀实验设备。化合物5的表征：图2红外图谱IR(KBr)νmax3022,2898,1740,1637,1607,1506,1480,-111396,1122,763,705cm；图3氢谱HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ=9.97(s,1H),9.07(s,1H),8.29(dd,J=37.3,9.3Hz,2H),8.01(d,J=16.1Hz,1H),7.91(dd,J=6.6,3.0Hz,2H),7.82(d,J=10.8Hz,1H),7.52(m,3H),7.09(d,J=15.9Hz,2H),6.20(s,2H),4.93(m,2H),4.05(m,131203H),3.21(m,2H);图4碳谱CNMR(100MHz,DMSO)δ=164.11,150.97,150.46,148.19,147.99,144.90,138.61,134.23,134.01,133.45,131.72,131.34,129.60,129.30,127.26,126.39,121.76,121.14,120.85,116.77,108.89,106.04,102.61,57.72,55.72,26.65;图5质谱+-+HRESIMSm/z(pos):487.12C28H22NO5Cl(calcd.[M﹣Cl]:452.1278)。确定其为目标合成物。加入三乙胺作缚酸剂，收率可达88%。当采用n(肉桂酸):n(小檗红碱)=4.5:1，5:1，5.5:1，1256:1时，化合物5的收率分别为65.8%，73.3%，86.4%，77.4%。因此，当n(肉桂酸):n(小檗红碱)=5.5:1时，产品产率最高。图2肉桂酸小檗红碱酯的红外图谱-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn130Fig.2Infraredspectraof9-O-cinnamicberberine图3肉桂酸小檗红碱酯的核磁共振氢谱15Fig.3HNMRof9-O-cinnamicberberine135图4肉桂酸小檗红碱酯的核磁共振碳谱13Fig.4CNMRof9-O-cinnamicberberine-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn140图5肉桂酸小檗红碱酯的质谱Fig.5Massspectrometryof9-O-cinnamicberberine4.2小鼠耳肿胀试验表1结果显示化合物5高、中、低剂量组小鼠的耳肿胀程度分别为5.54±0.37、6.08±0.61、8.07±0.44mg，与空白对照组11.60±0.88mg相比较，化合物5能明显降低由二甲苯引起的145小鼠耳肿胀程度，差异具有显著性，且成一定的剂量依赖性。结果表明化合物5对二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型具有抑制作用。化合物5高、中剂量组对小鼠耳肿胀的抑制率达52.24%及47.59%，与空白组、小檗碱组抑制率33.28%和肉桂酸组抑制率31.98%相比，化合物5高、中剂量组具有更高的抑制效率。低剂量组与小檗碱组和肉桂酸组抑制率并无显著性差异，这表明化合物5对二甲苯引起的小鼠耳肿胀模型具有抑制作用，并呈剂量依赖性。150表1化合物5各组对二甲苯引起的小鼠耳肿胀的影响Tab.1Effectsofcompound5groupsonearswellinginmicecausedbyxylene组别肿胀度(mg)抑制率(%)空白对照组11.60±0.880小檗碱组7.74±0.54**33.28肉桂酸组7.89±0.78**31.98△△化合物5高剂量组5.54±0.37**52.24△△化合物5中剂量组6.08±0.61**47.59化合物5低剂量组8.07±0.44**30.434.3小鼠血清中炎症因子水平测定155如表2结果显示，化合物5高、中、低剂量组小鼠血清中的IL-6、TNF-α水平相对于空白对照组显著降低，且呈一定的剂量依赖性。小檗碱组和肉桂酸组小鼠血清中的IL-6、TNF-α水平也明显低于空白对照组。化合物5高中剂量组的IL-6水平低于小檗碱组与肉桂酸组；化合物5低剂量组的IL-6水平低于小檗碱组，和肉桂酸组比较无明显差异。化合物5高、中、低剂量组的TNF-α水平皆明显低于小檗碱组与肉桂酸组。化合物5高、中、低剂量组160小鼠血清中的IL-6、TNF-α水平相对于空白对照组显著降低，且成一定的剂量依赖性。这些结果表明化合物5能够抑制小鼠耳肿胀以及降低小鼠血清中IL-6、TNF-α的水平，具有一定-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn的抗炎作用。表2化合物5各组小鼠血清中TNF-α、IL-6的比较Tab.2ComparisonofTNF-αandIL-6inserumofcompound5mice-1-1组别IL-6(pg·L)TNF-a(ng·L)空白对照组199.40±13.041855.71±67.93小檗碱组177.88±7.69*1527.45±126.22**△△肉桂酸组169.36±11.72**1496.60±127.42**△△△△化合物5高剂量组155.76±11.26**1147.65±108.16**△△化合物5中剂量组159.28±13.65**1158.34±98.36**△△化合物5低剂量组162.84±10.44**1226.36±86.02**165△△△与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，与小檗碱组比较，P<0.05，P<0.01。5结论本实验以小檗碱和肉桂酸为原料，通过去甲基化、乙酰化、成酯反应得到目标产物9-O-170肉桂酸小檗红碱酯。采用三乙胺做缚酸剂，可提高产品的收率和纯度，通过工艺优化得到当n(SOCl2):n(肉桂酸)=1.08:1，n(肉桂酸):n(小檗红碱)=5.5:1时产率最高（86.4%）。采用二甲苯致小鼠耳肿胀模型测定其抗炎活性，并通过小鼠血清测定IL-6、TNF-α的含量，实验表明肉桂酸小檗红碱酯能够抑制小鼠耳肿胀以及IL-6、TNF-α的含量，化合物5高、中剂量组对小鼠耳肿胀抑制作用明显高于小檗碱组与肉桂酸组。化合物5高、中剂量组的IL-6水平低175于小檗碱组与肉桂酸组；化合物5高、中、低剂量组的TNF-α水平皆明显低于小檗碱组与肉桂酸组。化合物5高、中、低剂量组小鼠血清中的IL-6、TNF-α水平相对于空白对照组显著降低，且成一定的剂量依赖性，表明具有良好的抗炎作用。致谢180本研究得到高等学校博士学科点专项科研基金-新教师类（20130162120078）；国家自然科学基金青年基金（81301258）；湖南省自然科学基金（2016JJ2161）；中南大学升华育英计划研究基金；张姗姗的研究生创新项目基金资助。[参考文献](References)185[1]李柱,刘丽华.黄连素联合格列吡嗪对2型糖尿病治疗效果的研究[J].医学临床研究,2007,24(1):61-64.[2]IWASAK,KAMIGAUCHIM,SUGIURAM,etal.Antimicrobialactivityofsome13-alkylsubstitutedprotoberberiniumsalt[J].PlantaMed,1997,63(3):196-198.[3]HONGSW,KIMSH,JEUNJA,etal.Antimicrobialactivityof9-O-acyl-and9-O-benzoyl-substitutedberberrubines[J].PlantaMed.2000,66(4):361-363.190[4]PARKKD,LEEJH,KIMSH,eta1.Synthesisof13-(substitutedbenzyl)berberineandberberrubinederivativesasantifungalagents[J].Bioorg.Med.Chem.Lett.,2006,16(15):3913-3916.[5]舒德忠.盐酸小檗碱对实验性小鼠结肠炎的作用研究[D].重庆医科大学,2005:5.[6]杜丽蕊,何贤辉,徐丽慧等.小檗碱对DNFB诱导的小鼠迟发型超敏反应得影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2005,21(4):418~421.-7- 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