茶条槭果酚酸含量、种类及体外生物活性的测定.pdf 11页

'中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn茶条槭果酚酸含量、种类及体外生物活性#的测定1,21112**冷艳涛，赵岩，于婷，张连学，奚广生5（1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春130118；2.吉林农业科技学院中药学院，吉林吉林132109）摘要：【目的】优化茶条槭果酚酸的提取工艺，测定酚酸种类、含量及其体外生物活性，为茶条槭果的开发利用提供依据。【方法】采用单因素试验及中心组合设计试验优化提取工艺，10确定最佳提取条件；采用反相高效液相色谱法分析最佳提取工艺提取出的酚酸的种类及含量；以水溶性维生素C(Vc)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)为对照品，测定酚酸的抗氧化活性，以Vc为对照品，测定酚酸对亚硝酸根的清除作用，以阿卡波糖为对照品，测定酚酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。【结果】超声波辅助提取茶条槭果酚酸的最佳工艺条件为：乙醇体积分数38%，超声时间36min，液固比162mL/g，此条件下茶条槭果酚酸提取率为15（26.20±0.45)%；测定出茶条槭果酚酸种类有8种，分别是：没食子酸(10.2063mg/g)、儿茶素(5.0757mg/g)、没食子酸甲酯(3.9441mg/g)、绿原酸(3.8279mg/g)、表儿茶素(0.4765mg/g)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(148.7293mg/g)、山梨酸(0.4088mg/g)、槲皮素(10.4201mg/g)；茶条槭果酚酸提取液对铁离子还原的IC50为(0.157±0.005)mg/mL,对DPPH自由基的半数抑制率IC50为(0.073±0.003)mg/mL，清除亚硝酸根的IC50为(0.059±0.003)20mg/mL，抑制α-葡萄糖苷酶的IC50为(0.329±0.015)mg/mL。【结论】中心组合设计-响应面分析法明显优化了茶条槭果酚酸的提取率，可以用于茶条槭果酚酸的提取；茶条槭果酚酸种类及含量的测定，为茶条槭果酚酸的分离提供了依据；茶条槭果酚酸类物质具有较高的抗氧化活性、清除亚硝酸根活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性。为茶条槭果的开发利用奠定了基础。25关键词：茶条槭果；酚酸；中心组合设计；响应面分析；反相高效液相色谱法；体外生物活性中图分类号：R284Acerginnalafruitphenolicacidandthebiologicalactivities30invitro1,21112LENGYantao,ZHAOYan,YUTing,ZHANGLianxue,XIGuangsheng(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun,Jilin130118,China;2.DepartmentofTraditionalChineseMedicineScience,JilinAgriculturalScienceand35TechnologyCollege,Jilin132109,China)Abstract:I【Objective】OptimizationofAcerginnalafruitphenolicacidextraction,determinationofphenolicacidscontent,anditsbiologicalactivityinvitro,providethebasisforthedevelopmentandutilizationofA.ginnalafruit.【Method】Theextractionprocesswasoptimizedbysinglefactortestanddesigntestcentercombination,determinetheoptimumextractionconditions;typeandcontentanalysis40toextractthebestextractionprocessbyreversed-phasehighperformanceliquidchromatographyofphenolicacids;Vc,BHTascontrolsample,determinationofantioxidantactivityofphenolicacids,withVcascontrolsample,determinationofphenolicacidsremovalofnitrite,acarboseascontrolsample,determinationofinhibitoryeffectsofphenolicacidsona-glycosidase.【Results】UltrasonicassistedextractionofA.ginnalafruitphenolicacidsintheoptimumconditionswere:ethanol45concentration38%,ultrasonictime36min,solid-liquidratioof162mL/g,Underthiscondition,基金项目：国家自然科学基金（31470420）,吉林省教育厅作者简介：冷艳涛(1988-),男,硕士研究生,主要从事天然药物化学与生物活性研究通信联系人：奚广生(1967-),男,教授,博导,主要从事药用植物品种选育及成分提取等研究.E-mail:zyxyxgs@126.com-1- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cnA.ginnalafruitphenolicacidextractionratewas(26.20+0.45)%;DeterminationofA.ginnalafruitphenolicacidsand8species,weregallicacid(10.2063mg/g),catechin(5.0757mg/g),methylgallate(3.9441mg/g),chlorogenicacid(3.8279mg/g),epicatechin(0.4765mg/g),1,2,3,4,6-fiveglucogallin(148.7293mg/g),sorbicacid(0.4088mg/g),quercetin(10.4201mg/g);Acerginnalafruitphenolicacid50extractonreductionofironionIC50(0.157+0.005)mg/mL,halfoftheDPPHradicalinhibitionrateofIC50(0.073+0.003)mg/mL,scavengingnitriteIC50(0.059+0.003)mg/mLinhibitionalphaglucosidaseIC50(0.329+0.015)mg/mL.【Conclusion】ThecentralcompositedesignandresponsesurfaceanalysismethodcanobviouslyoptimizetheteaextractionrateofphenolicacidsinfruitofAcer,A.ginnalafruitcanbeusedfortheextractionofphenolicacids;DeterminationofA.ginnalafruit55phenolicacidsandcontent,providethebasisforA.ginnalafruitphenolicacidseparation;antioxidationactivityofa.ginnalafruitphenolacidsarehigh,nitritescavengingactivity,inhibitionofalphaglucosidaseactivity.LaidthefoundationforthedevelopmentandutilizationofA.ginnalafruit.Keywords:A.ginnalafruit;phenolicacid;centralcompositedesign;responsesurfaceanalysis;HPLC;biologicalactivityinvitro600引言茶条槭（A.ginnalaMaxim）为槭树科槭树属的落叶大灌木或小乔木，叶、果供观赏。叶中含有酚酸类物质，其中以没食子酸为主，没食子酸又称倍酸，五倍子酸，应用范围很广，65主要用于药物、染料、墨水制造，也用做食品抗氧剂、防腐剂、金属提取剂、紫外线吸收剂、消毒剂、止血收敛剂、显影剂、化学试剂、泥浆流化剂和葡萄生长剂等。果为翅果，夏季果[1]翅红色美丽，秋叶又很易变成鲜红色，成熟后成黄绿色或黄褐色。茶条槭以叶、芽入药，[2]具有清热明目之功效，主治肝热目赤，昏花等。茶条槭叶还可做茶及保健品，主要用为抗[3]疲劳、免疫调节等。70研究表明以酚酸类物质为原料制成的药物可使肿瘤细胞的生长抑制或凋亡，还可作为抗氧剂，具有较强的抗氧化作用，酚酸类物质还具有一定的抑菌、抗衰老和对α-葡萄糖苷酶的[4-5]抑制作用。在国际医学上，以没食子酸为原料现已合成抗感染药品如四氧普林(TXP)、溴莫普林(BOP)和美替普林(MTP)；脑复清(Exifone)，用于治疗老年意识障碍；联苯双脂，用于治疗慢性肝炎；克冠卓、忧心平、心痛平，用于心绞痛、心衰、心肌梗塞恢复期等；通75牌酯，用于治疗脑血栓；Troxipide，用于治疗胃溃疡；克冠酸，用于治疗心肌梗塞；没食子[6-7]酸锑钠，用于治疗血吸虫；鞣花酸，用于防癌和抗癌。[8-9]由于茶条槭果资源极为丰富，且茶条槭果中含有大量的没食子酸，为此，本研究拟[1][10]采用响应面分析法测定茶条槭果中的类物质，同时采用反相高效液相色谱法测定茶条槭果中酚酸酸的种类及含量。并测定其酚酸类物质体外抗氧化活性、对α-葡萄糖苷酶的抑制作80用和对亚硝酸根的清除作用，旨在为茶条槭果的开发利用提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂原料：茶条槭果采自吉林农业大学药用植物园。试剂：没食子酸（北京百灵威科技有限公司），福林酚试剂（合肥博美生物），1,1-二85苯基-2-苦基肼(DPPH)、α-葡萄糖苷酶（≧5000u/g）（上海源叶生物科技有限公司），乙腈为色谱纯（霍尼韦尔-B＆J）；异硫氰酸苯酯(PITC)(Sigma公司)；没食子酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、山梨酸、槲皮素对照品（国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸甲酯和-2- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn五没食子酰基葡萄糖酸（实验室自制）；甲醇（色谱纯，Fisher公司）；其余试剂均为国产分析纯试剂。901.2仪器与设备CXTH-3000高效液相色谱仪（北京创新通恒科技有限公司）；UV-1800紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；KH-300DB型数控超声波（昆山市禾创超声仪器有限公司）；WD-2102A型自动酶标仪（北京市六一仪器厂）等。1.3方法951.3.1对照品溶液的制备-1取没食子酸适量，精密称定，加蒸馏水制成0.25mg·mL的溶液。取各酚酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成1.0mg·mL-1的溶液。。1.3.2供试品的制备（1）供试品溶液a取同一批次的茶条槭果0.5g，精密称定，按一定的液固比加入一定100体积分数的乙醇-水溶液，超声提取一定时间，过滤，备用。（2）供试品溶液b取同一批次的茶条槭果0.5g，精密称定，按酚酸最佳提取工艺进行提取，用0.45μm滤膜过滤，备用。（3）供试品c取同一批次的茶条槭果10g，精密称定，按酚酸最佳提取工艺进行提取，得到滤液后蒸干，备用。1051.3.3总酚含量的测定[11]采用Folin-Ciocalteu比色法测定供试品溶液a中酚酸的含量，并运用外标一点法计算茶条槭果酚酸含量（提取率）。1.3.4酚酸提取工艺优化试验采用单因素试验及中心组合设计试验优化茶条槭果酚酸提取工艺，具体试验参照茶条槭[1]110叶酚酸酸类物质提取的文献。1.3.5酚酸种类的测定[10]采用反相-高效液相色谱法分析供试品溶液b中酚酸类化合物。色谱条件为色谱柱：C18(250×4.6mm，5μm)；流动相：A：甲醇，B：1%醋酸水溶液；流动比例：0~40min，A:B=5:95~60:40；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：20μL。1151.3.6茶条槭果酚酸的抗氧化活性评价将供试品c配制成溶液，分别测定其对铁离子的还原能力及对DPPH自由基的清除能力，[1,12]从而衡量其抗氧化活性。具体试验方法参考相关文献。选取BHT和Vc为对照品。1.3.7茶条槭果提取物对亚硝酸盐的清除作用应用亚硝酸根在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化，再使其与盐酸萘乙二胺偶合生120成偶联化合物，测定溶液吸光度，计算亚硝酸盐清除率，并计算其IC50，IC50越小表明其[1,12]提取液对亚硝酸盐的清除能力越强。选取Vc为对照品，具体试验方法参考相关文献。-3- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1.3.8茶条槭果提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性通过葡萄糖氧化酶法测定反应体系中葡萄糖的生成量，计算供试品对α-葡萄糖苷酶活性的抑制率，并计算其IC50，IC50越小表明其提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制活性越强。选[13]125取阿卡波糖为对照品，具体试验方法参考相关文献。2结果与分析2.1提取茶条槭果酚酸的单因素试验（a）（b）130（c）图1乙醇体积分数（a）、超声提取时间（b）及液固比（c）对茶条槭果酚酸提取率的影响Fig.1Ethanolvolumefraction（a）、ultrasonicextractiontime（b）andtheliquid-solidratio（c）ontheinfluenceofA.ginnalafruittotalphenolextractionyield135考虑到现实生产中高体积分数乙醇更易回收，以及节约时间，减少浪费等问题，结合图1所示，将乙醇体积分数考察范围定为20%~80%、超声提取时间定为20~50min、液固比定为100~300mL/g。2.2提取茶条槭果酚酸的中心组合设计-响应面分析2.2.1试验方案及其结果140提取茶条槭果酚酸的中心组合设计试验方案及其结果详见表1，共进行了17组独立试验。-4- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表1提取茶条槭果酚酸的中心组合设计试验方案及其结果(n=3)x1x2x3Y试验号-1乙醇体积分数/%超声提取时间/min液固比/mL·g酚酸提取率/%1303512526.36±1.222303512524.72±1.133303512525.47±1.204484417023.35±0.99548448015.21±0.746482617022.16±0.06748268015.58±0.698124417019.17±0.91912448018.94±0.8910122617023.36±1.071112268024.24±1.161203512516.40±0.7913603512523.45±0.9214302012522.94±0.9015305012523.25±1.021630355020.55±0.817303520023.73±1.072.2.2响应面分析采用SAS9.1.3软件的RSREG（二次响应面回归模型）程序对表1中的试验结果进行响应145面分析，经二次回归拟合，得到回归模型参数估计值（表2）、方差分析表（表3）和脊岭分析表（表4）。表2提取茶条槭果酚酸的中心组合设计-响应面分析回归模型中回归系数的显著性检验结果参数自由度预测值标准差t值显著性截距19.48505620.9420470.45x11-0.1399180.31282-0.45x210.5905480.8374900.71x310.1100580.1556340.71x1×x11-0.0070900.002685-2.64*x2×x110.0079550.0061551.29x2×x21-0.0142720.010741-1.33x3×x110.0023720.0012311.93x3×x210.0008240.0024620.33x3×x31-0.0007090.000520-1.37注：*P﹤0.05，表示显著；**P﹤0.01，表示极显著；在P﹤0.2水平上拒绝假设。下同。150由表2可知，回归方程为：2Y=9.485056－0.139918x1+0.590548x2+0.110058x3－0.007090x1+0.007955x1x2－220.014272x2+0.002372x1x3+0.000824x2x3－0.000709x3155-5- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn表3提取茶条槭果酚酸的中心组合设计-响应面回归模型的方差分析2项目自由总离差平方相关系数RF值显著性度和总模型9139.2107940.74471.94线性项328.7696380.15391.21平方项366.7334180.35702.80交互项343.7077370.23381.83总误差647.724850失拟项446.37678317.20纯误差21.348067160从表3对回归方程的方差分析结果可以看出，总模型、线性项、平方项、交互项P>0.05，2表明其对提取率的影响不显著。相关性分析中，总模型的复相关系数R=0.7447，表明回归方程对酚酸提取率的预测值与实测值有较好的相关性。失拟项检验分析中，P>0.05，表明失拟性不显著，该回归方程无失拟因素存在，回归方程与实测值能较好拟合。165表4提取茶条槭果酚酸的中心组合设计-响应面回归模型的岭脊分析因子预测值编码半径响应预测值标准差x1x2x30.024.9681971.58398030.00000035.000000110.0000000.125.2876291.60574129.63931634.503875115.6161720.225.5452491.61696129.77714434.101169121.4400600.325.7496621.61863230.30331133.870372127.4130720.425.9083301.61345831.13144533.840687133.4387550.526.0277581.60573732.17798633.998741139.4106300.626.1131881.60177633.36875634.307793145.2553470.726.1685301.61033634.64840334.728173150.9437070.826.1965561.64245135.98069635.227578156.4768370.926.1992031.71024337.34355435.782715161.8699011.026.1778271.82483638.72390436.377564167.142025对回归方程的岭脊分析结果（表4）表明，方程预测的茶条槭果中酚酸最佳提取条件为：乙醇体积分数38%，超声提取时间36min，液固比162mL/g；在该条件下，酚酸的提取率为26.20%。为验证模型的有效性，对上述最佳提取条件进行了验证试验，结果平均提取率170为（26.20±1.19）%，试验值与预测值接近。进一步说明模型的可行性。为了更直观地表现2个因素同时对酚酸提取率的影响，可以令其他因素水平值在中心点（即编码水平为0），而仅考虑这2个因素对提取率的影响，得到的二元二次方程绘制的相应响应面图分别见图2－4。-6- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn175图2超声提取时间和液固比对茶条槭果酚酸提取率影响的等高线图（左）和响应面图（右）（固定乙醇体积分数为30%）180图3乙醇体积分数和液固比对茶条槭果酚酸提取率影响的等高线图（左）和响应面图（右）（固定提取时间为35min）图4乙醇体积分数和超声提取时间对茶条槭果酚酸提取率影响的等高线图（左）和响应面图（右）（固定185液固比为125mL/g）由图2-3所示，从等高线图和响应面的角度可以判断出，液固比对响应值的影响大于超声提取时间。液固比对响应值的影响略大于乙醇体积分数。乙醇体积分数对响应值的影响略大于超声提取时间。综上所述，液固比对酚酸得率的影响最大，乙醇体积分数次之，超声提取时间的影响较小。-7- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn1902.3酚酸种类的分析AB图5酚酸混合对照品溶液(A)、茶条槭果供试品(B)酚酸种类HPLC图（1没食子酸、2儿茶素、3、没食子酸甲酯、4绿原酸、5表儿茶素、61,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、1957山梨酸、8槲皮素）如图5所示，反相高效液相色谱法测定出茶条槭果酚酸共有8种，具体种类及含量如表5所示。200表5茶条槭果酚酸种类的测定结果没食子酸1,2,3,4,6-五没酚酸没食子酸儿茶素绿原酸表儿茶素山梨酸槲皮素甲酯食子酰葡萄糖含量10.20635.07573.94413.82790.4765148.72930.408810.4201（mg/g）2.4茶条槭果酚酸的抗氧化能力2.4.1对铁离子的还原能力10.80.6BHT吸光度值0.4Vc茶条槭果0.2000.20.40.60.81样品质量浓度（mg/mL）图6茶条槭果酚酸对铁离子的还原作用205由图6可知，茶条槭果提取液（响应面最优条件下）对三价铁离子具有很强的还原能力，随其质量浓度的增加而不断增强，其IC50为(0.205±0.010)mg/mL。在质量浓度为0.205mg/mL时，其铁离子还原能力分别是BHT、Vc的32.2%和40.0%。-8- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2.4.2对DPPH自由基的清除能力1008060BHTVc清除率(%)40茶条槭果2000.20.40.60.81样品质量浓度(mg/mL)210图7茶条槭果酚酸对DPPH自由基的清除作用由图7可知，茶条槭果提取液（响应面最优条件）对DPPH自由基具有很强的清除作用，在较低的质量浓度下即有较高的清除效果，且随其质量浓度的增加而不断增强，其IC50为215(0.002±0.0001)mg/mL。在质量浓度为0.002mg/mL时，其清除DPPH自由基的能力分别是BHT、Vc的5.5倍和16.3倍。2.5茶条槭果酚酸对亚硝酸根的清除作用959085(%)8075抑制率70656005101520样品质量浓度(mg/mL)图8茶条槭果酚酸对亚硝酸根的清除作用220由图8可知，茶条槭果提取液（响应面最优条件）对亚硝酸根具有一定的的清除作用，随其质量浓度的增加而不断增强，其IC50为(0.059±0.003)mg/mL。通过测定得阳性对照药[14]Vc的IC50值为(0.267±0.036）mg/mL，与文献相近。茶条槭果提取液质量浓度为0.059mg/mL时，其清除亚硝酸根的能力是Vc的4.5倍。-9- 中国科技论文在线http://www.paper.edu.cn2252.6茶条槭果酚酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用80757065抑制率(%)60555005101520样品质量浓度(mg/mL)图9茶条槭果酚酸对α-葡萄糖苷酶的抑制作用由图9可知，茶条槭果提取液（响应面最优条件）对α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用，230随其质量浓度的增加而不断增强，其IC50为(0.329±0.015)mg/mL。通过测定得阳性对照药阿[15]卡波糖在浓度为1.35mg/mL时的抑制率为50.33%与文献中相似。茶条槭果提取液质量浓度为0.329mg/mL时，其抑制α-葡萄糖苷酶的能力是阿卡波糖的4.1倍。3结论本试验在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对茶条槭果酚酸的提取工艺条件进行235了优化。结果表明，液固比对酚酸得率的影响最大，乙醇体积分数次之，超声提取时间的影响较小，最佳工艺条件为:液固比162mL/g，乙醇体积分数38%，提取时间36min。验证试验结果表明，茶条槭果酚酸的得率为(26.20±1.19)%。可用于优化茶条槭果酚酸的提取工艺条件，具有实用价值。本试验测定出茶条槭果酚酸种类有8种，分别是：没食子酸(10.2063mg/g)、儿茶素(5.0757240mg/g)、没食子酸甲酯(3.9441mg/g)、绿原酸(3.8279mg/g)、表儿茶素(0.4765mg/g)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(148.7293mg/g)、山梨酸(0.4088mg/g)、槲皮素(10.4201mg/g)；同时通过对茶条槭果酚酸抗氧化性（响应面最优条件下）的研究表明：茶条槭果原药材具有较强的抗氧化能力，茶条槭果酚酸提取液对铁离子还原力的IC50为(0.157±0.005)mg/mL，对DPPH自由基的半数抑制率IC50为(0.073±0.003)mg/mL；茶条槭果酚酸还具有较强的清除亚硝酸根的245能力，IC50为(0.059±0.003)mg/mL，较强的抑制α-葡萄糖苷酶的能力，IC50为(0.329±0.015)mg/mL。因此，茶条槭果酚酸类物质具有较高的抗氧化活性、清除亚硝酸根活性、抑制α-葡萄糖苷酶活性。对茶条槭果资源的开发和利用有积极作用，同时为工业生产提供了依据。[参考文献](References)250[1]赵岩,于婷,蔡恩博,等.茶条槭叶总酚的提取工艺优化及其抗氧化活性[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2016,44(1):177-184.[2]祁永会,吴晓春,张金蒙.茶条槭的开发展望[J].特种经济动植物,1998,(3):32.[3]毕武,何春年,彭勇,等.茶条槭叶石油醚部位化学成分研究[J].中国现代中药,2015,17(6):544-547.[4]LiuHY,QiuNX,DingHH,etal.Polyphenolscontentandantioxidantcapacityof68Chineseherbals255suitableformedicalorfooduses[J].FoodResearchInternational,2008,41(4):363-370.[5]BalasundramN,SundramK,SammanS.Phenoliccompoundsinplantsandagri-industrialby-products:antioxidantactivity,occurrence,andpotentialuse[J].FoodChemistry,2006,99(1):191-203.[6]汪荣斌,王存琴,刘晓龙,等.茶条槭化学成分及药食应用研究进展[J].安徽农业科技,2011,39(9):-10- 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